Трехцветная трансгенная мышиная модель для изучения повреждения пластин роста

Исследование проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями. Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Центра здоровья Университета Коннектикута до начала работ. Схема протокола приведена на рисунке 1 . Рисунок 1: Схема протокола повреждения пластины роста у трехцветных мышей с коллагеновым репортером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 1. Разведение мышей и подготовка к операции Разводите трехцветных трансгенных коллагеновых мышей-репортеров, экспрессирующих Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP и Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 в соответствии со стандартными процедурами разведения, чтобы получить щенков для операции в возрасте 2 недель (± 1 день). Проверьте экспрессию тройного трансгена путем генотипирования фрагмента кончика хвоста под флуоресцентным микроскопом. Используйте только мышей с положительным результатом на все три цвета, чтобы максимизировать пользу от репортерной системы во время последующего гистологического анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот возраст 2 недели (± 1 день) выбран потому, что их пластины роста костей находятся на той же стадии развития, что и у22-летнего подростка. Этот протокол распространяется на мышей обоих полов. В день операции или за день до нее однозначно идентифицируйте каждую мышь, используемую для операции, с помощью ушного прокола после дезинфекции уха и ушного прокола спиртовыми антисептическими подушечками, взвесьте каждую мышь и запишите значение. Выбрейте всю правую заднюю конечность от бедра до стопы электрической машинкой для стрижки, пока мышь находится под действием изофлурановой анестезии. Чтобы вызвать анестезию у мышей, используйте смесь изофлурана (2-3%) и 100% кислорода, вводимую со скоростью потока 1 л/мин в индукционной камере объемом 1-2 л. Извлеките мышь и убедитесь, что глубина анестезии достаточна, ущипнув палец ноги, который не должен заставить мышь двигаться.ПРИМЕЧАНИЕ: Такая глубина анестезии будет достаточно длительной, чтобы провести бритье без необходимости использования носового конуса для анестезии. Используйте рентгеновскую визуализацию с настройкой мощности 26 кВ (800 мА) для получения изображений большеберцовой кости у живых мышей под индуцированной изофлураном анестезией для записи начальной длины конечности.Перед помещением мышей в рентгеновский кабинет необходимо ввести состояние глубокой анестезии с помощью смеси изофлурана (2-3%) и 100% кислорода, вводимой со скоростью потока 1 л/мин в индукционной камере объемом 1-2 л. Поместите трех мышей под наркозом одновременно на их животы в рентгеновском кабинете на высоте полки, которая позволяет получить одно изображение, включающее всех трех мышей. Расставьте ноги, чтобы большеберцовые кости не заслонялись под мышкой. Для повышения точности измерений расположите рентгеноконтрастные весы рядом с мышью во время визуализации (рисунок 2A). Верните подготовленных мышей в их клетку с матерью-мышью, чтобы дождаться последующих хирургических процедур. 2. Подготовка хирургических принадлежностей и стерильной рабочей зоны Простерилизуйте следующие предметы: 10-20 марлевых салфеток, ватные тампоны для аппликаторов, зубные боры (диаметр 0,5 мм), стоматологические наконечники, щипцы Грефе, изогнутые кровоостанавливающие щипцы от комаров, изогнутые тонкие ножницы, иглодержатели, пародонтальные зонды и резчики по дискоидам зубов. Соберите дополнительные необходимые стерильные принадлежности: инъекционную суспензию бупренорфина, иглы 20 г, шприцы 1 мл, простыни для полотенец, 5-0 неокрашенных, плетеных, покрытых, викрильных швов, повидон-йод, фосфатно-солевой буфер, спиртовые антисептические салфетки, скальпели #15, хирургические перчатки, защитную поверхность окружающей среды трубку sox, глазную смазку, 70% этаноловый спрей. Включите стерилизатор со стеклянными шариками для дополнительной стерилизации предметов во время операции и электрическую грелку под чистой клеткой для мыши со стерилизованной подстилкой. Очистите и простерилизуйте предметный столик флуоресцентного стереомикроскопа, прилегающие поверхности и подставку для хирургических инструментов, используя 70% этанол. Закройте эти области, которые станут хирургическим рабочим местом, стерильными простынями для полотенец. Соберите электронную высокоскоростную систему сверления зубов. Подключите электронный ножной контроллер к блоку управления и накройте шнур наконечника продезинфицированной поверхностью барьерной трубки sox. Прикрепите стерильный круглый зубной бор толщиной 0,5 мм. Включите контроллер и установите его на передаточное число 1:1 и максимум 30 000 об/мин. Закрепите с помощью ленты гибкий изофлуран машинный шланг, который заканчивается носовым обтекателем, накрытым продезинфицированной поверхностной барьерной трубкой на предметном столике флуоресцентного стереомикроскопа. Включите флуоресцентный стереомикроскоп и вспомогательное оборудование и откройте программное обеспечение для получения изображений. Рисунок 2: Основные этапы процедуры травмирования мышиной пластины роста с помощью трехлинейного флуоресцентного репортера. (A) Измерение длины большеберцовой кости с помощью факситронной рентгеновской визуализации с использованием рентгеноконтрастной линейки, размещенной рядом с мышами в рентгеновском кабинете. (В) Правильное положение мыши, находящейся под наркозом, для проведения операции под флуоресцентным стереомикроскопом. Проксимальный отдел большеберцовой кости обозначен черной стрелкой. (C) Пример разреза, сделанного для доступа к пластине роста. (D) Флуоресцентная стереомикроскопия с выделением гипертрофированной зоны пластинки роста (белая стрелка). Прилегающая пролиферативная зона обозначена желтой стрелкой. (E) Яркое световое освещение хирурга, помещающего зубной бор диаметром 0,5 мм в пластину роста. (F) Точное размещение зубного бора осуществляется с помощью флуоресцентной стереомикроскопии в гипертрофической зоне. (G) Пример дефекта пластины роста типа II, подобного Солтеру-Харрису (белая стрелка). Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 3. Процедура травмирования наростовой пластины проксимального отдела большеберцовой кости Обезболивают мышь в анестезиологической камере изофлурана, регулируя концентрацию изофлурана до 2-3% и скорость потока кислорода до 1 л/мин. Дождитесь индукции глубокого обезболивающего состояния, подтвержденного тестом с щипцом ноги и наблюдением за дыхательными паттернами. Вводите половину назначенной дозы бупренорфина подкожно сразу после удаления мыши из камеры. Дозировка бупренорфина осуществляется в соответствии с утвержденным протоколом для животных. Нанесите глазную смазку, чтобы защитить глаза мыши от пересыхания во время операции, и перенесите мышь в лежачем положении на носовой конус изофлурана на предметном столике стереомикроскопа (рис. 2B). Отрегулируйте поток анестезии через носовой конус до 2% и скорость потока кислорода до 1 л/мин. Продезинфицируйте правую заднюю конечность, тазовую область, переднюю часть левой задней конечности и хвост последовательно повидон-йодом с последующим добавлением 70% этанола. Убедитесь в длительной стабильной глубине анестезии с помощью дополнительного теста на щипки пальцев ног и наблюдения за респираторными паттернами до начала операции. Под ярким световым освещением с помощью скальпеля #15 сделайте разрез на коже чуть ниже коленного сустава начальной длиной около 5 мм, чтобы открыть проксимальный конец правой большеберцовой кости (Рисунок 2C). При необходимости используйте ножницы, чтобы удлинить разрез. Держите левую контралатеральную большеберцовую кость неповрежденной, чтобы она служила внутренним неповрежденным контролем. Выполните вертикальное тупое рассечение через вышележащую мышцу в проксимальном отделе большеберцовой кости с помощью тыльной стороны скальпеля #15, удаляя мягкие ткани для четкого обнажения пластины роста. Выключите свет в операционной и выберите правильный канал флуоресценции, чтобы осветить нужную область пластины роста. Для визуализации каждого из флуоресцентных коллагенов требуются следующие наборы фильтров: Col 2 голубой: ET436/20x (возбуждение), ET480/40 м (излучение), Col 10 mCherry: ET577/20x (возбуждение), ET640/40 м (излучение), Col 1 Топаз: ET500/20x (возбуждение), ET535/30 м (излучение). Расположите мышь так, чтобы наблюдать за проксимальной пластинкой роста большеберцовой кости (рисунок 2D). Отрегулируйте отверстие кожи немного проксимальнее, а затем дистальнее, чтобы убедиться, что в поле зрения находится пластина роста большеберцовой кости, а не пластинка роста бедренной кости. Создайте поражение типа Солтера-Харриса типа II, глядя в окуляр микроскопа, расположив бор стоматологической бормашины диаметром 0,5 мм параллельно большеберцовой оси в середине зоны гипертрофированной пластинки роста, используя латеральный доступ (рис. 2E, F). Чтобы воспроизвести дефект, имитирующий поражение Солтера-Харриса II типа, держите конечность параллельно рабочей поверхности, чтобы путь входа бора не был наклонен в эпифиз. Надавите на педаль сверла, чтобы начать вращение бора, и осторожно вдавите бор в пластину роста, остановившись, прежде чем дефект углубится глубже, чем диаметр бора (Рисунок 2G).ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая пара рук, помогающая стабилизировать конечность мыши, полезна. Орошите место поражения каплей стерильного PBS, чтобы удалить любой мусор. Подтвердите глубину дефекта на расстоянии 0,5 мм с помощью пародонтального зонда. 4. Процедуры после травмы и закрытие Для определения характеристик с нулевым дефектом по времени соберите поврежденную заднюю конечность и контролируйте ее перед закрытием тканей. Следите за забором тканей и подготовкой к последующей микрокомпьютерной томографии (микрокомпьютерной томографии) и криогистологической визуализации в разделе 6.Примечание: Для экспериментов, включающих имплантацию терапевтического вещества в дефект пластинки роста, сам дефект может вместить только кусок биоматериала, который имеет примерно сферическую форму и диаметром 0,5 мм или объемом 0,082мм3 (0,082 мкл). Используйте щипцы под микроскопической визуализацией для введения биоматериала или введения жидкого терапевтического средства в дефект внутри ростовой пластинки. Используйте больший объем биоматериала или вводимого вещества, если дизайн исследования не требует, чтобы терапевтическое лечение ограничивалось только дефектом. Осторожно выровняйте края кожи, убедившись, что имплантированный материал, если таковой имеется, надежно остается в месте дефекта. Используйте прерывистые методы наложения швов с полигликолевой кислотой 5-0, чтобы эффективно закрыть разрез кожи. Тщательно очистите участки за пределами хирургической области от остатков повидон-йода с помощью тампонов со стерильной водой, стараясь избегать контакта с раной и близко прилегающими участками. Извлеките мышь из изофлуранового носового конуса на предметном столике микроскопа в клетку для восстановления, расположив ее сбоку на свежей подстилке над грелкой. Внимательно наблюдайте за частотой дыхания мыши в течение примерно 5 минут, вводя оставшуюся дозу бупренорфина для обезболивания как раз в тот момент, когда эффекты изофлурановой анестезии уменьшаются, на что указывает увеличение частоты дыхания, но до начала подвижности. Держите мышь в изолированной клетке для восстановления до тех пор, пока она не продемонстрирует полную способность к передвижению, после чего воссоедините ее с матерью и братьями и сестрами. Проводите ежедневные осмотры в течение первых 48 часов после операции, а затем еженедельные обследования вплоть до момента эвтаназии. Сосредоточьтесь на признаках инфекции, эффективности передвижения, доступности пищи и целостности швов. Отлучите мышей от груди в стандартное время (т.е. в возрасте 3 недель). 5. Измерение длины конечностей Основываясь на временных точках, определенных экспериментальной гипотезой и дизайном, обезболить мышей изофлураном и провести рентгенографическую визуализацию по всей длине как поврежденных, так и неповрежденных большеберцовых костей, как показано на рисунке 2А и описано в разделе 1.4. Подходящими ориентирами для последовательных измерений длины конечностей являются верхняя часть эпифиза большеберцовой кости и дистальный конец большеберцовой кости в большеберцовом суставе, как показано на рисунке 3.ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация используется для оценки разницы в длине и длине конечностей из-за травмы, а также развития костного моста в тканях пластины роста через определенные послеоперационные интервалы. 6. Диссекция тканей, фиксация, микрокомпьютерная томография и встраивание Усыпляйте мышь с помощью удушьяСО2 , предпочтительно с использованием автоматизированной системы индукцииСО2 с подтверждением смерти альтернативным методом, таким как вывих шейки матки. Изолируйте обе неповрежденные задние конечности и удалите кожу и мышцы из области кости и капсулы колена в рамках подготовки к гистологическому анализу и микрокомпьютерной томографии.Перед тем, как поместить задние конечности в фиксатор, осторожно иссеките надколенник, отрезав его с помощью микрорассекающих ножниц для облегчения фиксирующего проникновения в коленную полость. Используйте инсулиновый шприц 29 г для тщательного распределения холодного 10% буферного формалина по всем областям коленной полости. Тяжелая диафизарная область бедренной и большеберцовой костей для улучшения фиксирующего доступа к пространству костного мозга. Поддерживайте ткань сустава в полностью вытянутом положении в пределах фиксатора в течение 24-36 ч при температуре 4 °C, привязав ее марлей к тонкому дюбелю.ВНИМАНИЕ: Формалин токсичен и должен работать в вытяжном шкафу с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты. Через 24-48 ч фиксации формалина при 4 °С провести рентгенографическую микрокомпьютерную томографию с высоким разрешением контралатеральных и поврежденных образцов методом микрокомпьютерной томографии после переноса образцов в PBS для оценки развития костного моста. Используйте размер вокселя 6,0 мкм, время дискретизации 330 000 мс и настройки энергии 55 000 В с интенсивностью 145 мкА. После микрокомпьютерной томографии и дополнительных 24 ч фиксации формалина при 4 °C промойте образцы в 1X PBS в течение 3 x 5 минут, а затем погрузите образцы в 10% сахарозу в 1X PBS на 1 ч, 20% сахарозу в 1X PBS на 1 ч и 30% сахарозу в 1X PBS на ночь. Используйте инсулиновый шприц 29 г, наполненный раствором сахарозы, чтобы раствор сахарозы проник во все области коленной полости. Переложите в морозильную камеру при температуре -80 °C, если она не засыпается, после ночного погружения сахарозы, чтобы обеспечить сохранение репортера GFP и ферментативной активности тканей. Удалите остатки мышечной ткани из области сустава перед внедрением. Уравновесьте образец криосредой в течение ночи, способствуя проникновению среды в коленную полость. Просмотрите изображения микрокомпьютерной томографии, чтобы определить, где находится дефект и костный мост до встраивания. Нанесите тонкий слой криоэмбедирующей среды на криомолд и поместите рассеченную и все еще соединенную большеберцовую кость/бедренную кость/сустав таким образом, чтобы интересующая область была обращена под углом 90° к поверхности закладной среды.ПРИМЕЧАНИЕ: Такая ориентация позволяет при разрезании захватывать боковой вид дефекта, созданного сбоку. Если костный мост находится вблизи края дефекта, то такая ориентация также позволит избежать возможности пропустить интересующую область во время первых более толстых участков, проходящих через ткань. Поместите криомолд на сухой лед до тех пор, пока криосреда не затвердеет, закрепив образец. Продолжайте заполнять криомолд средой, держа ее на сухом льду. Закрепив образец, погрузите криомолд в охлажденный сухим льдом 2-метил-бутан до полного замерзания. После замораживания удалите избыток 2-метил-бутана, заверните криоформы в целлофан и храните при температуре -20 °C или -80 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: При длительном хранении более 1-2 месяцев в криозаверточной среде рекомендуется температура -80 °C для предотвращения высыхания. Ленточная криосекция и адгезия сечений к предметным стеклам описаны ранее23. 7. Последовательная визуализация, окрашивание и повторная визуализация Реализуйте последовательную процедуру визуализации, окрашивания и повторной визуализации для облегчения обнаружения и колокализации множественных биологических сигналов в пределах одного и того же участка ткани, как описано ранее23. В частности, для срезов пластины роста у мышей трехцветного коллагенового репортера рекомендуется выполнить следующие действия. Такой упорядоченный подход обеспечивает комплексную визуализацию как молекулярных сигналов, так и структурных деталей.Первоначально захватите эндогенные флуоресцентные сигналы для трех коллагенов в первом раунде визуализации. Нанесите окрашивание кальцеиновым синим цветом и изображение для минерализованной ткани23, а затем окрашивание и визуализацию ферментативной активностью тартрат-резистентной кислой фосфатазы (TRAP)23.ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что результаты окрашивания ферментативной активностью TRAP здесь не отображаются, этот этап окрашивания выполняется, поскольку он необходим для удаления минерала до того, как результаты окрашивания Safranin O/Fast Green представлены в разделе репрезентативных результатов. Проведите ядерное окрашивание 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), как описано ниже, а затем сделайте изображение.Поместите предметные стекла, прошедшие предварительную визуализацию, в банку Coplin, содержащую 1x PBS. Оставьте их погруженными до тех пор, пока покровные стекла не отсоединятся от слайдов. После отсоединения снимите и тщательно высушите покровные стекла. Нанесите противопятнящий раствор DAPI на покровные стекла, используя разведение DAPI в соотношении 1:1000 в смеси 50% глицерина и 1x PBS. Продолжайте процесс визуализации после нанесения. Завершите нанесением красителя Safranin O/Fast Green для акцентирования архитектуры тканей, а затем и изображения.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в качестве заключительного шага для корреляции хромогенных изображений с флуоресцентными сигналами.Приготовьте растворы гематоксилина железа Weigert. Приготовьте раствор А, растворив 1 г гематоксилина в 100 мл 95% этанола, и раствор В, смешав 4 мл 29% раствора хлорида железа, 95 мл деионизированной воды и 1 мл концентрированной HCl. Смешайте равные части раствора А и В, чтобы получить рабочий раствор гематоксилина Вайгерта, стабильный в течение примерно 4 недель. Погрузите горки в деионизированную воду на 2 х 2 минуты для увлажнения. Нанесите рабочий раствор гематоксилина Вейгерта на 5 минут. Промойте предметные стекла в водопроводной воде в течение 5 минут, затем кратковременно в деионизированной воде на 1 минуту. Окрашивать 0,2% раствором Fast Green (0,2 г Fast Green FCF в 100 мл деионизированной воды) в течение 2 мин. Кратковременно промыть в 1% уксусной кислоте в течение 1 мин. Окрашивать 0,1% раствором Сафранина О (0,1 г Сафранина О в 100 мл деионизированной воды) в течение 1 мин. Промойте в деионизированной воде до достижения визуально сбалансированного цвета, примерно 5 минут. Установите предметные стекла с 30% глицерином в деионизированную воду (избегайте PBS) и немедленно приступайте к визуализации, чтобы предотвратить диффузию цвета из ткани. Для выделения клеток зоны покоя ростовой пластины проводят изображение с помощью фильтра Cy5: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).