Modèle murin transgénique tricolore pour l’étude des lésions de la plaque de croissance

La recherche a été réalisée dans le respect des directives institutionnelles. Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du centre de santé de l’Université du Connecticut avant le début des travaux. Un aperçu du protocole est décrit dans le schéma de la figure 1 . Figure 1 : Aperçu du protocole de lésion de la plaque de croissance chez les souris rapporteures de collagène tricolore. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 1. Reproduction de souris et préparation à la chirurgie Élevez des souris rapporteures de collagène transgéniques tricolores qui expriment Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP et Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 selon les procédures d’élevage standard pour obtenir des chiots pour la chirurgie âgés de 2 semaines (± 1 jour). Vérifiez l’expression du triple transgène en génotypage d’un fragment de l’extrémité de la queue au microscope à fluorescence. N’utilisez que les souris qui sont positives pour les trois couleurs afin de maximiser les avantages du système rapporteur lors de l’analyse histologique ultérieure.REMARQUE : Cet âge de 2 semaines (± 1 jour) est choisi parce que leurs plaques de croissance osseuse sont à un stade de développement similaire à celui de l’adolescent humain22. Ce protocole s’applique aux deux sexes de souris. Le jour de l’intervention chirurgicale ou la veille, identifiez de manière unique chaque souris utilisée pour l’opération à l’aide d’un poinçon d’oreille après avoir désinfecté l’oreille et le poinçon d’oreille avec des tampons antiseptiques à base d’alcool, pesez chaque souris et notez la valeur. Rasez tout le postérieur droit de la hanche au pied à l’aide d’une tondeuse électrique pendant que la souris est sous l’effet de l’anesthésie à l’isoflurane. Pour induire l’anesthésie chez la souris, utilisez un mélange d’isoflurane (2-3%) et d’oxygène à 100%, administré à un débit de 1 L/min dans une chambre d’induction de 1-2 L. Retirez la souris et vérifiez que la profondeur de l’anesthésie est suffisante avec un pincement des orteils qui ne doit pas faire bouger la souris.REMARQUE : Cette profondeur d’anesthésie durera suffisamment longtemps pour effectuer le rasage sans nécessiter de cône nasal d’anesthésie. Utilisez l’imagerie par rayons X avec un réglage de puissance de 26 kV (800 mA) pour capturer des images tibiales chez des souris vivantes sous anesthésie induite par l’isoflurane afin d’enregistrer la longueur initiale des membres.Avant de placer les souris dans l’armoire à rayons X, induire un état d’anesthésie profond à l’aide d’un mélange d’isoflurane (2-3%) et d’oxygène à 100%, administré à un débit de 1 L/min dans une chambre d’induction de 1-2 L. Placez trois souris anesthésiées à la fois en parallèle sur leur estomac dans l’armoire de radiologie à une hauteur d’étagère qui permet d’obtenir une image incluant les trois souris. Écartez les pattes pour que les os tibiaux ne soient pas obscurcis sous la souris. Pour une meilleure précision de mesure, placez une échelle radio-opaque près de la souris pendant l’imagerie (Figure 2A). Remettez les souris préparées dans leur cage d’hébergement avec la souris mère pour attendre les interventions chirurgicales ultérieures. 2. Préparation du matériel chirurgical et zone de travail stérile Stérilisez les articles suivants : 10 à 20 compresses de gaze, tampons applicateurs à bout de coton, fraises dentaires (0,5 mm de diamètre), pièces à main dentaires, pinces Graefe, pinces hémostatiques incurvées pour moustiques, ciseaux fins incurvés, porte-aiguilles, sondes parodontales et sculpteurs discoïdes dentaires cléoïdes. Rassemblez les fournitures stériles supplémentaires nécessaires : une suspension injectable de buprénorphine, des aiguilles de 20 g, des seringues de 1 ml, des draps de serviette, des sutures 5-0 non teintes, tressées, enduites, vicryl, de la povidone iodée, du sérum physiologique tamponné au phosphate, des tampons antiseptiques à l’alcool, des scalpels #15, des gants chirurgicaux, un tube de barrière de surface environnementale sox, un lubrifiant pour les yeux, un spray d’éthanol à 70 %. Mettez sous tension un stérilisateur à billes de verre pour une stérilisation supplémentaire des articles pendant l’opération et le coussin chauffant électrique sous une cage à souris propre avec une litière stérilisée. Nettoyez et stérilisez la platine du stéréomicroscope à fluorescence, les surfaces adjacentes et le support de l’instrument chirurgical avec de l’éthanol à 70 %. Couvrez ces zones qui deviendront l’espace de travail chirurgical avec des champs de serviette stériles. Assemblez le système de forage dentaire électronique à grande vitesse. Connectez la pédale électronique à l’unité de commande et couvrez le cordon de la pièce à main avec un tube de barrière de surface désinfecté sox. Fixez la fraise dentaire ronde stérile de 0,5 mm. Allumez la manette et réglez-la sur un rapport d’entraînement de 1:1 et un maximum de 30 000 tr/min. Fixez, à l’aide de ruban adhésif, le tuyau flexible de la machine à isoflurane qui se termine par le cône nasal recouvert d’un tube barrière de surface désinfecté sox sur la platine du stéréomicroscope à fluorescence. Mettez sous tension le stéréomicroscope à fluorescence et l’équipement auxiliaire, puis ouvrez le logiciel d’acquisition d’images. Figure 2 : Étapes clés de la procédure de lésion de la plaque de croissance murine rapporteure fluorescente trilineage. (A) Mesure de la longueur tibiale par imagerie par rayons X par faxitron à l’aide d’une règle radio-opaque placée le long des souris dans la cabine de radiographie. (B) Position correcte d’une souris anesthésiée pour la chirurgie sous un stéréomicroscope à fluorescence. Tibia proximal indiqué par une flèche noire. (C) Un exemple d’incision pratiquée pour accéder à la plaque de croissance. (D) Stéréomicroscopie à fluorescence éclairant la zone hypertrophique de la plaque de croissance (flèche blanche). La zone proliférative adjacente est indiquée par une flèche jaune. (E) Éclairage à la lumière vive du chirurgien plaçant la fraise dentaire de 0,5 mm contre la plaque de croissance. (F) Le placement précis de la fraise dentaire est guidé par stéréomicroscopie à fluorescence dans la zone hypertrophique. (G) Un exemple d’un défaut de plaque de croissance de type Salter-Harris de type II (flèche blanche). Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 3. Procédure de lésion de la plaque de croissance du tibia proximal Anesthésie la souris dans la chambre d’anesthésie à l’isoflurane, en ajustant la concentration d’isoflurane à 2-3 % et le débit d’oxygène à 1 L/min. Attendez l’induction d’un état anesthésique profond, vérifié par un test de pincement des orteils et l’observation des schémas respiratoires. Administrer la moitié de la dose prescrite de buprénorphine par voie sous-cutanée immédiatement après le retrait de la souris de la chambre. La posologie de la buprénorphine est conforme au protocole animal approuvé. Appliquez un lubrifiant oculaire pour protéger les yeux de la souris contre le dessèchement pendant l’intervention chirurgicale et transférez la souris en position couchée sur le cône nasal de la machine à isoflurane sur la platine du stéréomicroscope (Figure 2B). Ajustez le débit d’anesthésie à travers le cône nasal à 2 % et le débit d’oxygène à 1 L/min. Désinfectez le membre postérieur droit, la région pelvienne, la face antérieure du membre postérieur gauche et la queue séquentiellement avec de la povidone iodée suivie de 70 % d’éthanol. Vérifiez la stabilité et la profondeur de l’anesthésie au moyen d’un test supplémentaire de pincement des orteils et de l’observation des schémas respiratoires avant le début de la chirurgie. Sous un éclairage lumineux, utilisez un scalpel #15 pour créer une incision dans la peau juste en dessous de l’articulation du genou d’une longueur initiale d’environ 5 mm, afin de révéler l’extrémité proximale du tibia droit (Figure 2C). Utilisez des ciseaux pour allonger la coupe si nécessaire. Gardez le tibia controlatéral gauche non blessé afin qu’il serve de contrôle interne non blessé. Effectuez une dissection contondante verticale à travers le muscle sus-jacent au niveau du tibia proximal à l’aide de la face arrière du scalpel #15, en retirant les tissus mous pour une exposition claire de la plaque de croissance. Éteignez les lumières de la salle d’opération et sélectionnez le bon canal de fluorescence pour éclairer la région souhaitée de la plaque de croissance. Les ensembles de filtres nécessaires pour imager chacun des collagènes fluorescents sont Col 2 Cyan : ET436/20x (excitation), ET480/40 m (émission), Col 10 mCherry : ET577/20x (excitation), ET640/40 m (émission), Col 1 Topaz : ET500/20x (excitation), ET535/30 m (émission). Positionnez la souris de manière à ce qu’elle observe la plaque de croissance tibiale proximale (Figure 2D). Ajustez l’ouverture de la peau légèrement plus proximale, puis distale pour vous assurer que la plaque de croissance tibiale est visible et non la plaque de croissance du fémur. Créez une lésion de type Salter-Harris de type II tout en regardant à travers l’oculaire du microscope en positionnant la fraise de foret dentaire de 0,5 mm parallèlement à l’axe tibial au milieu de la zone de la plaque de croissance hypertrophique, en utilisant une approche latérale (Figure 2E,F). Pour obtenir de manière reproductible un défaut qui imite une lésion de Salter-Harris de type II, gardez le membre parallèle à la surface de travail afin que la voie d’entrée de la fraise ne s’incline pas dans l’épiphyse. Appliquez une pression sur la pédale de perceuse pour amorcer la rotation de la fraise et enfoncez doucement la fraise dans la plaque de croissance, en arrêtant avant que le défaut ne s’enfonce plus profondément que le diamètre de la fraise (Figure 2G).REMARQUE : Une deuxième paire de mains aidant à stabiliser le membre de la souris est utile. Irriguez le site de la lésion avec une goutte de PBS stérile pour éliminer tous les débris. Confirmez la profondeur du défaut à 0,5 mm à l’aide d’une sonde parodontale. 4. Procédures post-blessure et fermeture Pour la caractérisation du défaut au temps zéro, prélever le membre postérieur blessé et le membre témoin avant la fermeture du tissu. Suivez le prélèvement de tissus et la préparation pour la microtomodensitométrie ultérieure (microTDM) et l’imagerie cryo-histologique dans la section 6.REMARQUE : Dans le cas d’expériences impliquant l’implantation d’une substance thérapeutique dans le défaut de la plaque de croissance, le défaut lui-même ne peut accueillir qu’un morceau de biomatériau à peu près sphérique et de 0,5 mm de diamètre ou de 0,082 mm3 (0,082 μL) de volume. Utilisez des pinces sous visualisation microscopique pour insérer le biomatériau ou injectez un produit thérapeutique liquide dans le défaut de la plaque de croissance. Utiliser un plus grand volume de biomatériau ou de substance injectée si la conception de l’étude n’exige pas que le traitement soit limité au seul défaut. Réalignez soigneusement les bords de la peau, en vous assurant que le matériau implanté, le cas échéant, reste solidement à l’intérieur du site du défaut. Utilisez des techniques de suture interrompue avec des sutures à l’acide polyglycolique 5-0 pour sceller efficacement l’incision cutanée. Nettoyez soigneusement les zones au-delà de la région chirurgicale des résidus de povidone iodée à l’aide d’écouvillons avec de l’eau stérile, en prenant soin d’éviter tout contact avec la plaie et les zones environnantes proches. Retirez la souris du cône nasal de l’isoflurane sur la platine du microscope jusqu’à une cage de récupération, en la positionnant latéralement sur une litière fraîche au-dessus d’un coussin chauffant. Observez de près la fréquence respiratoire de la souris pendant environ 5 minutes, en administrant la dose restante de buprénorphine pour l’analgésie au moment où les effets de l’anesthésie à l’isoflurane diminuent, indiqués par une augmentation de la fréquence respiratoire, mais avant le début de la mobilité. Maintenez la souris dans une cage de récupération isolée jusqu’à ce qu’elle démontre toutes ses capacités ambulatoires, puis réunissez-la avec sa mère et ses frères et sœurs. Effectuer des inspections quotidiennes pendant les 48 heures suivant l’opération, suivies d’évaluations hebdomadaires jusqu’au moment de l’euthanasie. Concentrez-vous sur les signes d’infection, l’efficacité de la locomotion, l’accessibilité à la nourriture et l’intégrité des sutures. Sevrez les souris à l’heure normale (c’est-à-dire à l’âge de 3 semaines). 5. Mesure de la longueur des membres Sur la base des points temporels déterminés par l’hypothèse et la conception expérimentales, anesthésier les souris avec de l’isoflurane et effectuer une imagerie par rayons X de toute la longueur des tibias blessés et non blessés, comme le montre la figure 2A et décrit dans la section 1.4. Les points de repère appropriés pour effectuer des mesures cohérentes de la longueur des membres comprennent le haut de l’épiphyse tibiale et l’extrémité distale du tibia au niveau de l’articulation tibio-talienne, comme le montre la figure 3.REMARQUE : L’imagerie est utilisée pour évaluer les écarts de longueur et de longueur des membres dus à la blessure, ainsi que le développement du pont osseux dans les tissus de la plaque de croissance à des intervalles postopératoires spécifiques. 6. Dissection tissulaire, fixation, imagerie microCT et intégration Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 , de préférence à l’aide d’un système automatisé d’induction de CO2 avec confirmation de la mort par une autre méthode telle que la luxation cervicale. Isolez les deux membres postérieurs intacts et retirez la peau et les muscles de l’os et de la région capsulaire du genou en préparation de l’analyse histologique et de la microtomodensitométrie.Avant de mettre les membres postérieurs dans le fixateur, excisez soigneusement la rotule en la coupant à l’aide de micro-ciseaux de dissection pour faciliter la pénétration du fixateur dans la cavité du genou. Utilisez une seringue à insuline de 29 g pour bien répartir le formol tamponné à 10 % dans toutes les zones de la cavité du genou. Sévère la région diaphysaire du fémur et du tibia pour améliorer l’accès fixateur à l’espace de la moelle. Maintenez le tissu articulaire en position complètement déployée à l’intérieur du fixateur pendant 24 à 36 h à 4 °C en l’attachant avec de la gaze à une cheville mince.ATTENTION : Le formol est toxique et doit être manipulé dans une hotte tout en portant un équipement de protection individuelle approprié. Après 24 à 48 h de fixation au formol à 4 °C, effectuer une microtomodensitométrie à rayons X à haute résolution des échantillons controlatéraux et blessés par imagerie microCT après transfert des échantillons au PBS, pour l’évaluation du développement du pont osseux. Utilisez une taille de voxel de 6,0 μm, des temps d’échantillonnage de 330 000 ms et des réglages d’énergie de 55 000 V avec une intensité de 145 μA. Après l’imagerie microCT et 24 h supplémentaires de fixation au formol à 4 °C, rincez les échantillons dans 1X PBS pendant 3 x 5 minutes, puis immergez les échantillons dans 10 % de saccharose dans 1X PBS pendant 1 h, 20 % de saccharose dans 1X PBS pendant 1 h et 30 % de saccharose dans 1X PBS pendant la nuit. Utilisez une seringue d’insuline de 29 g remplie de solution de saccharose pour vous assurer que la solution de saccharose pénètre dans toutes les régions de la cavité du genou. Transférer dans un congélateur à -80 °C si ce n’est pas le cas, après l’immersion nocturne dans le saccharose, afin d’assurer la rétention du rapporteur GFP et de l’activité enzymatique tissulaire. Retirez tout tissu musculaire résiduel de la région articulaire avant de l’encastrer. Équilibrez l’échantillon avec un milieu cryo-enrobé pendant la nuit, facilitant la pénétration du fluide dans la cavité du genou. Visualisez les images microCT pour déterminer où se trouvent le défaut et le pont osseux avant l’encastrement. Appliquez une fine couche du milieu de cryo-enrobage dans un cryomoule et placez le tibia/fémur/articulation disséqué et toujours connecté de manière à ce que la région d’intérêt soit orientée à 90° par rapport à la surface du milieu d’enrobage.REMARQUE : Cette orientation permet à la coupe de capturer la vue latérale du défaut créé latéralement. Si le pont osseux est près du bord du défaut, cette orientation évitera également la possibilité de manquer la région d’intérêt lors des premières sections plus épaisses prélevées à travers le tissu. Placez le cryomoule sur de la glace carbonique jusqu’à ce que le milieu de cryo-enrobage se solidifie, fixant ainsi l’échantillon. Continuez à remplir le cryomoule avec le fluide tout en le maintenant sur de la glace sèche. Après avoir fixé l’échantillon, immergez le cryomoule dans du 2-méthyl-butane refroidi avec de la glace sèche jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé. Après la congélation, retirez l’excès de 2-méthyl-butane, enveloppez les cryomoules dans du cellophane et conservez-les à -20 °C ou -80 °C.REMARQUE : Pour un stockage prolongé au-delà de 1 à 2 mois dans un milieu cryo-enrobé, -80 °C est recommandé pour éviter le dessèchement. La cryosectionnement assistée par bande et l’adhérence des sections sur les lames de verre sont décrits précédemment23. 7. Imagerie séquentielle, coloration et réimagerie Mettre en œuvre une procédure séquentielle d’imagerie, de coloration et de réimagerie pour faciliter la détection et la colocalisation de plusieurs signaux biologiques dans la même section de tissu, comme décrit précédemment23. En particulier pour les sections de plaque de croissance des souris rapporteures de collagène tricolore, les étapes suivantes sont recommandées. Cette approche ordonnée garantit une visualisation complète des signaux moléculaires et des détails structurels.Dans un premier temps, capturez des signaux fluorescents endogènes pour les trois collagènes lors de la première série d’imagerie. Appliquer la coloration au bleu de calcéine et l’image pour les tissus minéralisés23, suivie de la coloration et de l’imagerie de l’activité enzymatique de la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)23.REMARQUE : Bien que les résultats de coloration de l’activité enzymatique TRAP ne soient pas affichés ici, cette étape de coloration est effectuée car elle est essentielle pour l’élimination du minéral avant les résultats de coloration Safranin O/Fast Green présentés dans la section des résultats représentatifs. Effectuez la coloration nucléaire du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) comme décrit ci-dessous, puis imagez.Placez les lames qui ont fait l’objet d’une imagerie préalable dans un bocal Coplin contenant 1x PBS. Laissez-les immergés jusqu’à ce que les lamelles se détachent des glissières. Une fois détachés, retirez et séchez soigneusement les lamelles. Appliquez une solution de contre-coloration DAPI sur les lamelles, en utilisant une dilution de 1:1 000 de DAPI dans un mélange de 50 % de glycérol et de 1x PBS. Poursuivez le processus d’imagerie après l’application. Terminez par l’application de la coloration Safranin O/Fast Green pour accentuer l’architecture tissulaire, puis l’image.REMARQUE : Effectuez cette étape comme étape finale pour corréler les images chromogènes avec les signaux fluorescents.Préparez les solutions d’hématoxyline de fer de Weigert. Préparez la solution A en dissolvant 1 g d’hématoxyline dans 100 ml d’éthanol à 95 % et la solution B en combinant 4 ml de solution de chlorure ferrique à 29 %, 95 ml d’eau désionisée et 1 ml de HCl concentré. Mélangez à parts égales les solutions A et B pour créer la solution d’hématoxyline fonctionnelle de Weigert, stable pendant environ 4 semaines. Immerger les lames dans de l’eau déminéralisée pendant 2 x 2 min pour s’hydrater. Appliquez la solution d’hématoxyline de Weigert pendant 5 min. Lavez les lames à l’eau du robinet pendant 5 min, puis brièvement à l’eau déminéralisée pendant 1 min. Colorer avec une solution Fast Green à 0,2 % (0,2 g de Fast Green FCF dans 100 mL d’eau déminéralisée) pendant 2 min. Rincer brièvement avec de l’acide acétique à 1 % pendant 1 min. Colorer avec une solution de Safranine O à 0,1 % (0,1 g de Safranine O dans 100 mL d’eau déminéralisée) pendant 1 min. Rincer à l’eau déminéralisée jusqu’à l’obtention d’une couleur visuellement équilibrée, environ 5 min. Montez les lames dans du glycérol à 30 % dans de l’eau désionisée (évitez le PBS) et passez immédiatement à l’imagerie pour éviter la diffusion de la couleur du tissu. Pour accentuer les cellules de la zone de repos de la plaque de croissance, on conduit l’image avec un filtre Cy5 : ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).