Modelo murino transgénico tricolor para el estudio de la lesión del cartílago de crecimiento

La investigación se realizó de acuerdo con los lineamientos institucionales. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Salud de la Universidad de Connecticut antes de iniciar el trabajo. En el esquema de la Figura 1 se describe un esquema del protocolo. Figura 1: Esquema del protocolo de lesión del cartílago de crecimiento en ratones reporteros de colágeno tricolor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 1. Cría de ratones y preparación para la cirugía Cría ratones reporteros de colágeno transgénico tricolor que expresen Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP y Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 según los procedimientos de cría estándar para obtener cachorros para cirugía que tengan 2 semanas de edad (± 1 día). Verificar la expresión del triple transgén mediante el genotipado de un fragmento de la punta de la cola bajo un microscopio de fluorescencia. Utilice únicamente los ratones que sean positivos para los tres colores para maximizar el beneficio del sistema indicador durante el análisis histológico posterior.NOTA: Se selecciona esta edad de 2 semanas de edad (± 1 día) porque sus placas de crecimiento óseo se encuentran en una etapa de desarrollo similar a la del adolescente humano22. Este protocolo se aplica a ambos sexos de ratones. El día de la cirugía o un día antes, identifique de manera única cada ratón utilizado para la cirugía con un punzón en la oreja después de desinfectar la oreja y el punzón en la oreja con almohadillas antisépticas con alcohol, pesar cada ratón y registrar el valor. Afeitar toda la extremidad trasera derecha, desde la cadera hasta el pie, con una maquinilla eléctrica mientras el ratón está bajo el efecto de la anestesia con isoflurano. Para inducir la anestesia en ratones, se utiliza una mezcla de isoflurano (2-3%) y oxígeno al 100%, administrada a un caudal de 1 L/min dentro de una cámara de inducción de 1-2 L. Retire el ratón y confirme que la profundidad de la anestesia es suficiente con un pellizco en el dedo del pie que no haga que el ratón se mueva.NOTA: Esta profundidad de anestesia durará el tiempo suficiente para realizar el afeitado sin necesidad de un cono nasal de anestesia. Emplee imágenes de rayos X con una configuración de potencia de 26 kV (800 mA) para capturar imágenes tibiales en ratones vivos bajo anestesia inducida por isoflurano para registrar la longitud inicial de la extremidad.Antes de colocar los ratones en la cabina de rayos X, inducir un estado profundo de anestesia utilizando una mezcla de isoflurano (2-3%) y oxígeno al 100%, administrada a un caudal de 1 L/min dentro de una cámara de inducción de 1-2 L. Coloque tres ratones anestesiados a la vez en paralelo sobre sus estómagos en el gabinete de rayos X a una altura de estante que permita obtener una imagen que incluya a los tres ratones. Separe las piernas para que los huesos tibiales no se oscurezcan debajo del ratón. Para mejorar la precisión de la medición, coloque una escala radiopaca cerca del ratón durante la obtención de imágenes (Figura 2A). Regrese los ratones preparados a su jaula de alojamiento con la madre ratón para esperar los procedimientos quirúrgicos posteriores. 2. Preparación de material quirúrgico y área de trabajo estéril Esterilice los siguientes artículos: 10-20 almohadillas de gasa, hisopos aplicadores con punta de algodón, fresas dentales (0,5 mm de diámetro), piezas de mano dentales, pinzas de Graefe, pinzas hemostáticas curvas para mosquitos, tijeras finas curvas, portaagujas, sondas periodontales y talladores discoidales de cleoides dentales. Reúna los suministros estériles adicionales necesarios: una suspensión inyectable de buprenorfina, agujas de 20 G, jeringas de 1 ml, cortinas de toalla, suturas de vicryl 5-0 sin teñir, trenzadas, recubiertas, povidona-yodo, solución salina tamponada con fosfato, almohadillas antisépticas con alcohol, bisturíes # 15, guantes quirúrgicos, tubo de barrera de superficie ambiental SOX, lubricante para ojos, aerosol de etanol al 70%. Encienda un esterilizador de perlas de vidrio para la esterilización adicional de artículos durante la cirugía y la almohadilla térmica eléctrica debajo de una jaula de ratón limpia con ropa de cama esterilizada. Limpie y esterilice la platina del microscopio estereoscópico de fluorescencia, las superficies adyacentes y el soporte del instrumento quirúrgico con etanol al 70%. Cubra estas áreas que se convertirán en el espacio de trabajo quirúrgico con paños de toalla estériles. Ensamble el sistema electrónico de perforación dental de alta velocidad. Conecte el pedal electrónico a la unidad de control y cubra el cable de la pieza de mano con un tubo de barrera de superficie desinfectado SOX. Coloque la fresa dental redonda estéril de 0,5 mm. Encienda el controlador y configúrelo en una relación de transmisión de 1:1 y un máximo de 30,000 rpm. Asegure, con cinta adhesiva, la manguera flexible de la máquina de isoflurano que termina con el cono de la nariz cubierto con un tubo de barrera de superficie desinfectado sox en la platina del microscopio estereoscópico de fluorescencia. Encienda el microscopio estereoscópico de fluorescencia y el equipo auxiliar y abra el software de adquisición de imágenes. Figura 2: Pasos clave del procedimiento de lesión de la placa de crecimiento murina reportera fluorescente de tres linajes. (A) Medición de la longitud de la tibia mediante imágenes de rayos X de faxitrón utilizando una regla radiopaca colocada junto a los ratones en el gabinete de rayos X. (B) Posición correcta de un ratón anestesiado para la cirugía bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Tibia proximal indicada por una flecha negra. (C) Un ejemplo de una incisión hecha para acceder a la placa de crecimiento. (D) Microscopía estereoscópica de fluorescencia que ilumina la zona hipertrófica de la placa de crecimiento (flecha blanca). La zona proliferativa adyacente se indica con una flecha amarilla. (E) Iluminación de luz brillante del cirujano colocando la fresa dental de 0,5 mm contra la placa de crecimiento. (F) La colocación precisa de la fresa dental es guiada por microscopía estereoscópica de fluorescencia en la zona hipertrófica. (G) Un ejemplo de un defecto de la placa de crecimiento tipo II de Salter-Harris (flecha blanca). Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Procedimiento de lesión de la placa de crecimiento proximal de la tibia Anestesiar al ratón en la cámara de anestesia de isoflurano, ajustando la concentración de isoflurano al 2-3% y el caudal de oxígeno a 1 L/min. Esperar la inducción de un estado anestésico profundo, verificado por una prueba de pinzamiento del dedo del pie y la observación de patrones respiratorios. Administrar la mitad de la dosis prescrita de buprenorfina por vía subcutánea inmediatamente después de retirar el ratón de la cámara. La dosificación de buprenorfina se realiza según el protocolo aprobado para animales. Aplique lubricante ocular para proteger los ojos del ratón para que no se sequen durante la cirugía y transfiera el ratón en posición supina al cono de la nariz de la máquina de isoflurano en la platina de microscopio estereoscópico (Figura 2B). Ajuste el flujo de anestesia a través del cono de la nariz al 2% y el caudal de oxígeno a 1 L/min. Desinfectar la extremidad posterior derecha, la región pélvica, la cara anterior de la extremidad posterior izquierda y la cola secuencialmente con povidona yodada seguida de etanol al 70%. Verifique una profundidad estable y continua de la anestesia a través de una prueba adicional de pinzamiento de los dedos del pie y la observación de los patrones respiratorios antes del comienzo de la cirugía. Bajo una iluminación de luz brillante, emplee un bisturí # 15 para crear una incisión en la piel justo debajo de la articulación de la rodilla con una longitud inicial de aproximadamente 5 mm, para revelar el extremo proximal de la tibia derecha (Figura 2C). Use tijeras para extender el corte si es necesario. Mantenga la tibia contralateral izquierda intacta para que sirva como un control interno sin lesiones. Realice una disección roma vertical a través del músculo suprayacente en la tibia proximal utilizando la parte posterior del bisturí # 15, eliminando el tejido blando para una exposición clara de la placa de crecimiento. Apague las luces del quirófano y seleccione el canal de fluorescencia correcto para iluminar la región deseada de la placa de crecimiento. Los conjuntos de filtros necesarios para obtener imágenes de cada uno de los colágenos fluorescentes son Col 2 Cian: ET436/20x (excitación), ET480/40 m (emisión), Col 10 mCherry: ET577/20x (excitación), ET640/40 m (emisión), Col 1 Topacio: ET500/20x (excitación), ET535/30 m (emisión). Coloque el ratón para observar la placa de crecimiento tibial proximal (Figura 2D). Ajuste la abertura de la piel un poco más proximal y luego distal para asegurarse de que la placa de crecimiento tibial esté a la vista y no la placa de crecimiento del fémur. Cree una lesión similar a la de Salter-Harris tipo II mientras mira a través del ocular del microscopio colocando la fresa del taladro dental de 0,5 mm paralela al eje tibial en el centro de la zona de la placa de crecimiento hipertrófica, empleando un abordaje lateral (Figura 2E, F). Para producir de manera reproducible un defecto que imite una lesión de Salter-Harris tipo II, mantenga la extremidad paralela a la superficie de trabajo para que la vía de entrada de la fresa no se incline hacia la epífisis. Aplique presión sobre el pedal del taladro para iniciar la rotación de la fresa y presione suavemente la fresa en la placa de crecimiento, deteniéndose antes de que el defecto sea más profundo que el diámetro de la fresa (Figura 2G).NOTA: Un segundo par de manos que ayudan a estabilizar la extremidad del ratón es útil. Irrigar el sitio de la lesión con una gota de PBS estéril para eliminar cualquier residuo. Confirme la profundidad del defecto a 0,5 mm con una sonda periodontal. 4. Procedimientos posteriores a la lesión y cierre Para la caracterización de defectos de tiempo cero, coseche la extremidad posterior lesionada y la extremidad de control antes del cierre del tejido. Siga la recolección de tejido y la preparación para la posterior microtomografía computarizada (microTC) y criohistología en la sección 6.NOTA: En el caso de los experimentos que implican la implantación de una sustancia terapéutica en el defecto del cartílago de crecimiento, el defecto en sí solo puede acomodar una pieza de biomaterial que sea aproximadamente esférica y de 0,5 mm de diámetro o 0,082 mm3 (0,082 μL) de volumen. Utilice fórceps bajo visualización microscópica para insertar el biomaterial o inyectar un líquido terapéutico en el defecto dentro de la placa de crecimiento. Utilizar un volumen mayor de biomaterial o sustancia inyectada si el diseño del estudio no requiere que la terapéutica se limite únicamente al defecto. Vuelva a alinear cuidadosamente los bordes de la piel, asegurándose de que el material implantado, si lo hay, permanezca seguro dentro del sitio del defecto. Emplee técnicas de sutura interrumpida con suturas de ácido poliglicólico 5-0 para sellar la incisión cutánea de manera efectiva. Limpie a fondo las áreas más allá de la región quirúrgica de residuos de povidona yodada con hisopos con agua estéril, aplicando cuidado para evitar el contacto con la herida y las áreas circundantes cercanas. Retire el ratón del cono de la nariz de isoflurano en la platina del microscopio y colóquelo en una jaula de recuperación, colocándolo lateralmente sobre ropa de cama fresca sobre una almohadilla térmica. Observar de cerca la frecuencia respiratoria del ratón durante aproximadamente 5 min, administrando la dosis restante de buprenorfina para la analgesia justo cuando los efectos del anestésico isoflurano disminuyen, indicados por un aumento de la frecuencia respiratoria, pero antes del inicio de la movilidad. Mantenga al ratón en una jaula de recuperación aislada hasta que demuestre capacidades ambulatorias completas, a partir de entonces, reuniéndolo con su madre y hermanos. Realizar inspecciones diarias durante las primeras 48 horas después de la operación, seguidas de evaluaciones semanales hasta el momento de la eutanasia. Concéntrese en los signos de infección, la eficacia de la locomoción, la accesibilidad a los alimentos y la integridad de las suturas. Desteta a los ratones a la hora estándar (es decir, a las 3 semanas de edad). 5. Medidas de la longitud de las extremidades Sobre la base de los puntos de tiempo determinados por la hipótesis experimental y el diseño, anestesiar a los ratones con isoflurano y realizar imágenes de rayos X de la longitud total de las tibias lesionadas y no lesionadas, como se muestra en la Figura 2A y se describe en la Sección 1.4. Los puntos de referencia adecuados para realizar mediciones consistentes de la longitud de las extremidades incluyen la parte superior de la epífisis tibial y el extremo distal de la tibia en la articulación tibioastragalina, como se muestra en la Figura 3.NOTA: Las imágenes se utilizan para evaluar la longitud de la extremidad y las discrepancias en la longitud de la extremidad debido a la lesión, así como el desarrollo del puente óseo dentro de los tejidos de la placa de crecimiento a intervalos postoperatorios específicos. 6. Disección de tejidos, fijación, imágenes por microTC e inclusión Eutanasia del ratón mediante asfixia por CO2 , preferiblemente utilizando un sistema automatizado de inducción de CO2 con una confirmación de muerte por un método alternativo como la luxación cervical. Aísle ambas extremidades traseras intactas y extraiga la piel y el músculo del hueso y el área capsular de la rodilla en preparación para el análisis histológico y microCT.Antes de colocar las extremidades traseras en el fijador, extirpe la rótula con cuidado cortándola con unas tijeras de microdisección para facilitar la penetración del fijador en la cavidad de la rodilla. Utilice una jeringa de insulina de 29 g para distribuir completamente la formalina fría tamponada al 10% en todas las áreas de la cavidad de la rodilla. Cortar la región diafisaria del fémur y la tibia para mejorar el acceso del fijador al espacio medular. Mantenga el tejido articular en una posición completamente extendida dentro del fijador durante 24-36 h a 4 °C atándolo con una gasa a una clavija fina.PRECAUCIÓN: La formalina es tóxica y debe manipularse en una campana extractora mientras se usa el equipo de protección personal adecuado. Después de 24-48 h de fijación de formalina a 4 °C, realizar microTC de rayos X de alta resolución de muestras contralaterales y lesionadas mediante imágenes de microCT después de transferir las muestras a PBS, para evaluar el desarrollo del puente óseo. Utilice un tamaño de vóxel de 6,0 μm, tiempos de muestreo de 330.000 ms y ajustes de energía de 55.000 V con una intensidad de 145 μA. Después de la obtención de imágenes por microTC y 24 h adicionales de fijación de formalina a 4 °C, enjuague las muestras en 1X PBS durante 3 x 5 min y luego, sumerja las muestras en sacarosa al 10% en 1X PBS durante 1 h, 20% de sacarosa en 1X PBS durante 1 h y 30% de sacarosa en 1X PBS durante la noche. Use una jeringa de insulina de 29 G llena de solución de sacarosa para asegurarse de que la solución de sacarosa penetre en todas las regiones de la cavidad de la rodilla. Transfiera a un congelador a -80 °C si no está incluido después de la inmersión nocturna en sacarosa para garantizar la retención del indicador de GFP y la actividad enzimática de los tejidos. Retire cualquier tejido muscular residual de la región de la articulación antes de incrustar. Equilibre la muestra con un medio crioincrustante durante la noche, facilitando la penetración del medio en la cavidad de la rodilla. Vea las imágenes de microCT para determinar dónde se encuentran el defecto y el puente óseo antes de la inclusión. Aplique una capa delgada del medio crio-incrustante en un criommoldo y coloque la tibia/fémur/articulación disecada y aún conectada de manera que la región de interés mire 90° con respecto a la superficie del medio de inclusión.NOTA: Esta orientación permite que el seccionamiento capture la vista lateral del defecto creado lateralmente. Si el puente óseo está cerca del borde del defecto, entonces esta orientación también evitará la posibilidad de pasar por alto la región de interés durante las primeras secciones más gruesas tomadas a través del tejido. Coloque el criommould sobre hielo seco hasta que el medio crioincrustante se solidifique, asegurando la muestra. Continúe llenando el criomold con el medio mientras lo mantiene en hielo seco. Después de asegurar la muestra, sumerja el criomold en 2-metil-butano enfriado con hielo seco hasta que esté completamente congelado. Después de la congelación, elimine el exceso de 2-metil-butano, envuelva los criomoldes en celofán y guárdelos a -20 °C o -80 °C.NOTA: Para un almacenamiento prolongado más allá de 1-2 meses en un medio crioincrustado, se recomienda -80 °C para evitar que se seque. La criosección asistida por cinta y la adhesión de las secciones a los portaobjetos de vidrio se describen anteriormente23. 7. Imágenes secuenciales, tinción y regeneración de imágenes Implementar un procedimiento secuencial de obtención de imágenes, tinción y regeneración de imágenes para facilitar la detección y colocalización de múltiples señales biológicas dentro de la misma sección de tejido, como se describió anteriormente23. Específicamente para las secciones de la placa de crecimiento de los ratones reporteros de colágeno tricolor, se recomiendan los siguientes pasos. Este enfoque ordenado garantiza una visualización completa tanto de las señales moleculares como de los detalles estructurales.Inicialmente, captura señales fluorescentes endógenas para los tres colágenos en la primera ronda de imágenes. Aplique la tinción con azul de calceína y la imagen del tejido mineralizado23, seguida de la tinción con actividad enzimática de la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y la obtención de imágenes23.NOTA: Si bien los resultados de la tinción con actividad enzimática TRAP no se muestran aquí, este paso de tinción se realiza ya que es esencial para la eliminación del mineral antes de los resultados de la tinción de Safranin O/Fast Green presentados en la sección de resultados representativos. Realice la tinción nuclear de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) como se describe a continuación y luego la imagen.Coloque los portaobjetos que hayan sido sometidos a imágenes previas en un frasco Coplin que contenga 1x PBS. Déjalos sumergidos hasta que los cubreobjetos se desprendan de los portaobjetos. Una vez desmontados, retire y seque bien los cubreobjetos. Aplique la solución contratintante DAPI a los cubreobjetos, utilizando una dilución 1:1,000 de DAPI en una mezcla de 50% de glicerol y 1x PBS. Continúe con el proceso de creación de imágenes después de la aplicación. Concluir con la aplicación de la tinción Safranin O/Fast Green para acentuar la arquitectura del tejido y luego la imagen.NOTA: Realice esto como paso final para correlacionar imágenes cromogénicas con señales fluorescentes.Prepare las soluciones de hematoxilina de hierro de Weigert. Prepare la solución A disolviendo 1 g de hematoxilina en 100 ml de etanol al 95% y la solución B combinando 4 ml de solución de cloruro férrico al 29%, 95 ml de agua desionizada y 1 ml de HCl concentrado. Mezcle partes iguales de la solución A y B para crear la solución de hematoxilina de trabajo de Weigert, estable durante aproximadamente 4 semanas. Sumerja los portaobjetos en agua desionizada durante 2 x 2 min para hidratarse. Aplique la solución de hematoxilina de Weigert durante 5 min. Lave los portaobjetos en agua del grifo durante 5 minutos, luego brevemente en agua desionizada durante 1 minuto. Teñir con una solución de Fast Green al 0,2% (0,2 g de Fast Green FCF en 100 mL de agua desionizada) durante 2 min. Enjuague brevemente con ácido acético al 1% durante 1 min. Manchar con solución de Safranina O al 0,1% (0,1 g de Safranina O en 100 mL de agua desionizada) durante 1 min. Enjuague con agua desionizada hasta lograr un color visualmente equilibrado, aproximadamente 5 min. Monte los portaobjetos en glicerol al 30% en agua desionizada (evite PBS) y proceda a la obtención de imágenes de inmediato para evitar la difusión del color del tejido. Para acentuar las células de la zona de reposo de la placa de crecimiento, conducen la imagen con un filtro Cy5: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).