Modello murino transgenico tricolore per lo studio delle lesioni della cartilagine di crescita

La ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali. Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali (IACUC) dell’Università del Connecticut prima di iniziare il lavoro. Uno schema del protocollo è descritto nello schema della Figura 1 . Figura 1: Schema del protocollo di lesione della cartilagine di crescita nei topi reporter con collagene tricolore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 1. Allevamento di topi e preparazione per l’intervento chirurgico Alleva topi reporter di collagene transgenico tricolore che esprimono Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP e Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 secondo le procedure di allevamento standard per ottenere cuccioli per intervento chirurgico di 2 settimane (± 1 giorno). Verificare l’espressione del triplo transgene genotipizzando un frammento della punta della coda al microscopio a fluorescenza. Utilizzare solo i topi positivi per tutti e tre i colori per massimizzare il beneficio del sistema reporter durante la successiva analisi istologica.NOTA: Questa età di 2 settimane (± 1 giorno) è selezionata perché le loro placche di crescita ossea sono in uno stadio di sviluppo simile a quello dell’adolescente umanodi 22 anni. Questo protocollo si applica a entrambi i sessi di topi. Il giorno dell’intervento o un giorno prima, identificare in modo univoco ogni topo utilizzato per l’intervento chirurgico utilizzando un punzone per le orecchie dopo aver disinfettato l’orecchio e il punzone per le orecchie con tamponi antisettici imbevuti di alcol, pesare ciascun topo e registrare il valore. Radere l’intero arto posteriore destro dall’anca al piede con un tagliacapelli elettrico mentre il topo è sotto l’effetto dell’anestesia con isoflurano. Per indurre l’anestesia nei topi, utilizzare una miscela di isoflurano (2-3%) e ossigeno al 100%, somministrata a una velocità di flusso di 1 L/min all’interno di una camera di induzione da 1-2 L. Rimuovere il mouse e verificare che la profondità dell’anestesia sia sufficiente con un pizzico di dita che non dovrebbe causare il movimento del mouse.NOTA: Questa profondità di anestesia durerà sufficientemente a lungo per condurre la rasatura senza richiedere un cono per l’anestesia. Utilizzare l’imaging a raggi X con un’impostazione di potenza di 26 kV (800 mA) per acquisire immagini tibiali in topi vivi in anestesia indotta da isoflurano per registrare la lunghezza iniziale dell’arto.Prima di posizionare i topi nella cabina radiografica, indurre un profondo stato di anestesia utilizzando una miscela di isoflurano (2-3%) e ossigeno al 100%, somministrata a una velocità di flusso di 1 L/min all’interno di una camera di induzione da 1-2 L. Posizionare tre topi anestetizzati alla volta in parallelo sullo stomaco nella cabina radiografica a un’altezza dello scaffale che consenta di ottenere un’immagine che includa tutti e tre i topi. Allarga le gambe in modo che le ossa tibiali non siano oscurate sotto il topo. Per una maggiore precisione di misurazione, posizionare una scala radiopaca vicino al mouse durante l’imaging (Figura 2A). Rimetti i topi preparati nella loro gabbia di alloggiamento con il topo madre in attesa delle successive procedure chirurgiche. 2. Preparazione di forniture chirurgiche e area di lavoro sterile Sterilizzare i seguenti elementi: 10-20 garze, tamponi applicatori con punta di cotone, frese dentali (diametro 0,5 mm), manipoli dentali, pinze Graefe, pinze emostatiche per zanzare curve, forbici fini curve, portaaghi, sonde parodontali e intagliatori discoidi cleoidi dentali. Raccogliere ulteriori forniture sterili necessarie: una sospensione iniettabile di buprenorfina, aghi da 20 G, siringhe da 1 ml, teli per asciugamani, suture 5-0 non colorate, intrecciate, rivestite, in vicryl, iodio povidone, soluzione salina tamponata con fosfato, tamponi antisettici imbevuti di alcol, bisturi #15, guanti chirurgici, sox per tubi barriera ambientale per superfici, lubrificante per gli occhi, spray all’etanolo al 70%. Accendi uno sterilizzatore a perle di vetro per un’ulteriore sterilizzazione degli oggetti durante l’intervento chirurgico e il termoforo elettrico sotto una gabbia per mouse pulita con lettiera sterilizzata. Pulire e sterilizzare il tavolino dello stereomicroscopio a fluorescenza, le superfici adiacenti e il supporto dello strumento chirurgico utilizzando il 70% di etanolo. Copri queste aree che diventeranno l’area di lavoro chirurgica con teli sterili. Assemblare il sistema elettronico di perforazione dentale ad alta velocità. Collegare il pedale reostato elettronico all’unità di controllo e coprire il cavo del manipolo con un tubo barriera per superfici disinfettato sox. Applicare la fresa dentale rotonda sterile da 0,5 mm. Accendere il controller e impostarlo su un rapporto di trasmissione di 1:1 e un massimo di 30.000 giri/min. Fissare, con del nastro adesivo, il tubo flessibile della macchina all’isoflurano che termina con il cono del naso coperto da un tubo barriera superficiale disinfettato sox sullo stadio dello stereomicroscopio a fluorescenza. Accendere lo stereomicroscopio a fluorescenza e l’apparecchiatura ausiliaria e aprire il software di acquisizione delle immagini. Figura 2: Passaggi chiave della procedura di lesione della cartilagine murina reporter fluorescente a trilinea. (A) Misurazione della lunghezza tibiale mediante imaging a raggi X con faxitrone utilizzando un righello radiopaco posizionato accanto ai topi nella cabina radiografica. (B) Posizione corretta di un topo anestetizzato per la chirurgia sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Tibia prossimale indicata da una freccia nera. (C) Un esempio di incisione praticata per accedere alla cartilagine di accrescimento. (D) Microscopia stereoscopica a fluorescenza che illumina la zona ipertrofica della cartilagine di crescita (freccia bianca). La zona proliferativa adiacente è indicata da una freccia gialla. (E) Illuminazione a luce intensa del chirurgo che posiziona la fresa dentale da 0,5 mm contro la placca di accrescimento. (F) Il posizionamento preciso della fresa dentale è guidato dalla stereoscopia a fluorescenza nella zona ipertrofica. (G) Un esempio di difetto della placca di crescita simile a Salter-Harris di tipo II (freccia bianca). Barre della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 3. Procedura di lesione della cartilagine di accrescimento prossimale della tibia Anestetizzare il topo nella camera di anestesia dell’isoflurano, regolando la concentrazione di isoflurano al 2-3% e la portata di ossigeno a 1 L/min. Attendere l’induzione di uno stato anestetico profondo, verificato da un test di pizzicamento delle dita dei piedi e dall’osservazione dei modelli respiratori. Somministrare metà della dose prescritta di buprenorfina per via sottocutanea immediatamente dopo la rimozione del topo dalla camera. Il dosaggio della buprenorfina è conforme al protocollo animale approvato. Applicare lubrificante oculare per proteggere gli occhi del topo dalla secchezza durante l’intervento chirurgico e trasferire il topo in posizione supina sul cono del naso della macchina per isoflurano sul tavolino dello stereomicroscopio (Figura 2B). Regolare il flusso di anestesia attraverso il cono nasale al 2% e la portata di ossigeno a 1 L/min. Disinfettare l’arto posteriore destro, la regione pelvica, l’aspetto anteriore dell’arto posteriore sinistro e la coda in sequenza con iodio povidone seguito da etanolo al 70%. Verificare una profondità stabile e continua dell’anestesia attraverso un ulteriore test di pizzicamento delle dita dei piedi e l’osservazione dei modelli respiratori prima dell’inizio dell’intervento chirurgico. In condizioni di luce intensa, utilizzare un bisturi #15 per creare un’incisione nella pelle appena sotto l’articolazione del ginocchio con una lunghezza iniziale di circa 5 mm, per rivelare l’estremità prossimale della tibia destra (Figura 2C). Usa le forbici per estendere il taglio, se necessario. Mantenere illesa la tibia controlaterale sinistra in modo che funga da controllo interno illeso. Eseguire una dissezione smussata verticale attraverso il muscolo sovrastante della tibia prossimale utilizzando il lato posteriore del bisturi #15, rimuovendo il tessuto molle per una chiara esposizione della cartilagine di crescita. Spegnere le luci della sala operatoria e selezionare il canale di fluorescenza corretto per illuminare la regione desiderata della piastra di crescita. I set di filtri necessari per l’imaging di ciascuno dei collageni fluorescenti sono Col 2 Ciano: ET436/20x (eccitazione), ET480/40 m (emissione), Col 10 mCherry: ET577/20x (eccitazione), ET640/40 m (emissione), Col 1 Topazio: ET500/20x (eccitazione), ET535/30 m (emissione). Posizionare il mouse per osservare la cartilagine di accrescimento tibiale prossimale (Figura 2D). Regolare l’apertura della pelle leggermente più prossimale e poi distale per assicurarsi che la cartilagine di accrescimento tibiale sia in vista e non la cartilagine di accrescimento del femore. Creare una lesione simile a quella di Salter-Harris di tipo II mentre si guarda attraverso l’oculare del microscopio posizionando la fresa dentale da 0,5 mm parallela all’asse tibiale al centro della zona della cartilagine di crescita ipertrofica, utilizzando un approccio laterale (Figura 2E, F). Per creare in modo riproducibile un difetto che imita una lesione di Salter-Harris di tipo II, mantenere l’arto parallelo alla superficie di lavoro in modo che la via di ingresso della fresa non si inclini nell’epifisi. Applicare pressione sul pedale del trapano per avviare la rotazione della fresa e premere delicatamente la fresa nella piastra di crescita, fermandosi prima che il difetto vada oltre il diametro della fresa (Figura 2G).NOTA: Un secondo paio di mani che aiutano a stabilizzare l’arto del mouse è utile. Irrigare il sito della lesione con una goccia di PBS sterile per rimuovere eventuali detriti. Confermare la profondità del difetto a 0,5 mm utilizzando una sonda parodontale. 4. Procedure post infortunio e chiusura Per la caratterizzazione del difetto a tempo zero, prelevare l’arto posteriore ferito e controllare l’arto prima della chiusura del tessuto. Seguire il prelievo dei tessuti e la preparazione per la successiva tomografia microcomputerizzata (microCT) e l’imaging crio-istologico nella sezione 6.NOTA: Per gli esperimenti che prevedono l’impianto di una sostanza terapeutica nel difetto della cartilagine di crescita, il difetto stesso può ospitare solo un pezzo di biomateriale approssimativamente sferico e di 0,5 mm di diametro o 0,082 mm3 (0,082 μL) di volume. Utilizzare una pinza sotto visualizzazione microscopica per inserire il biomateriale o iniettare un terapeutico liquido nel difetto all’interno della piastra di crescita. Utilizzare un volume maggiore di biomateriale o sostanza iniettata se il disegno dello studio non richiede che la terapia sia limitata al solo difetto. Riallineare con cura i bordi della pelle, assicurandosi che il materiale impiantato, se presente, rimanga saldamente all’interno del sito del difetto. Utilizzare tecniche di sutura interrotta con suture di acido poliglicolico 5-0 per sigillare efficacemente l’incisione cutanea. Detergere accuratamente le aree oltre la regione chirurgica dai residui di iodio povidone utilizzando tamponi con acqua sterile, facendo attenzione a evitare il contatto con la ferita e le aree circostanti. Rimuovere il mouse dal cono del naso dell’isoflurano sul tavolino del microscopio in una gabbia di recupero, posizionandolo lateralmente su una lettiera fresca sopra un termoforo. Osservare attentamente la frequenza respiratoria del topo per circa 5 minuti, somministrando la dose rimanente di buprenorfina per l’analgesia proprio quando gli effetti dell’anestesia con isoflurano diminuiscono, indicati da un aumento della frequenza respiratoria, ma prima dell’inizio della mobilità. Tenere il topo in una gabbia di recupero isolata fino a quando non dimostra le piene capacità deambulatorie, dopodiché, ricongiungendolo con la madre e i fratelli. Condurre ispezioni giornaliere per le prime 48 ore dopo l’operazione, seguite da valutazioni settimanali fino al punto di eutanasia. Concentrati sui segni di infezione, sull’efficacia della locomozione, sull’accessibilità al cibo e sull’integrità delle suture. Svezzare i topi all’ora standard (cioè 3 settimane di età). 5. Misure della lunghezza degli arti Sulla base dei punti temporali determinati dall’ipotesi sperimentale e dal disegno, anestetizzare i topi con isoflurano e condurre l’imaging a raggi X dell’intera lunghezza delle tibie lese e non danneggiate come mostrato nella Figura 2A e descritto nella sezione 1.4. I punti di riferimento adatti per effettuare misurazioni coerenti della lunghezza degli arti includono la parte superiore dell’epifisi tibiale e l’estremità distale della tibia all’articolazione tibioastragalica, come mostrato nella Figura 3.NOTA: L’imaging viene utilizzato per valutare la lunghezza degli arti e le discrepanze nella lunghezza degli arti dovute alla lesione, nonché lo sviluppo del ponte osseo all’interno dei tessuti della cartilagine di crescita a specifici intervalli post-operatori. 6. Dissezione tissutale, fissazione, imaging microCT e inclusione Eutanasia del topo tramite asfissia da CO2 , preferibilmente utilizzando un sistema automatizzato di induzione di CO2 con una conferma di morte con un metodo alternativo come la lussazione cervicale. Isolare entrambi gli arti posteriori intatti e rimuovere la pelle e il muscolo dall’osso e dall’area capsulare del ginocchio in preparazione per l’analisi istologica e microCT.Prima di inserire gli arti posteriori nel fissativo, asportare accuratamente la rotula tagliandola con le forbici da micro-dissezione per facilitare la penetrazione del fissativo nella cavità del ginocchio. Utilizzare una siringa da insulina da 29 G per distribuire accuratamente la formalina tamponata fredda al 10% in tutte le aree della cavità del ginocchio. Grave la regione diafisaria del femore e della tibia per migliorare l’accesso fissativo allo spazio midollare. Mantenere il tessuto articolare in posizione completamente estesa all’interno del fissativo per 24-36 ore a 4 °C legandolo con una garza a un tassello sottile.ATTENZIONE: La formalina è tossica e deve essere maneggiata in una cappa aspirante indossando adeguati dispositivi di protezione individuale. Dopo 24-48 ore di fissazione in formalina a 4 °C, eseguire una microCT a raggi X ad alta risoluzione di campioni controlaterali e danneggiati mediante imaging microCT dopo aver trasferito i campioni al PBS, per la valutazione dello sviluppo del ponte osseo. Utilizza una dimensione del voxel di 6,0 μm, tempi di campionamento di 330.000 ms e impostazioni di energia di 55.000 V con un’intensità di 145 μA. Dopo l’imaging microCT e altre 24 ore di fissazione in formalina a 4 °C, sciacquare i campioni in 1X PBS per 3 x 5 minuti e quindi immergere i campioni in 10% di saccarosio in 1X PBS per 1 ora, 20% di saccarosio in 1X PBS per 1 ora e 30% di saccarosio in 1X PBS durante la notte. Utilizzare una siringa da insulina da 29 G riempita con soluzione di saccarosio per assicurarsi che la soluzione di saccarosio permei tutte le regioni della cavità del ginocchio. Trasferire in un congelatore a -80 °C se non incorporato dopo l’immersione notturna nel saccarosio per garantire il mantenimento del reporter GFP e dell’attività enzimatica tissutale. Rimuovere il tessuto muscolare residuo dalla regione articolare prima dell’incorporamento. Equilibrare il campione con un mezzo di crioinclusione durante la notte, facilitando la penetrazione del mezzo nella cavità del ginocchio. Visualizzate le immagini della microCT per determinare dove si trovano il difetto e il ponte osseo prima dell’incorporazione. Applicare uno strato sottile del mezzo di crioinclusione in un criomold e posizionare la tibia/femore/articolazione sezionata e ancora collegata in modo tale che la regione di interesse sia rivolta a 90° rispetto alla superficie del mezzo di inclusione.NOTA: Questo orientamento consente al sezionamento di catturare la vista laterale del difetto creato lateralmente. Se il ponte osseo si trova vicino al bordo del difetto, questo orientamento eviterà anche la possibilità di perdere la regione di interesse durante le prime sezioni più spesse prelevate attraverso il tessuto. Posizionare il criopoldo su ghiaccio secco fino a quando il mezzo di crioinclusione non si solidifica, fissando il campione. Continua a riempire il criopoldo con il mezzo mantenendolo su ghiaccio secco. Dopo aver fissato il campione, immergere il criomold in 2-metil-butano raffreddato con ghiaccio secco fino a completo congelamento. Dopo il congelamento, rimuovere l’eccesso di 2-metilbutano, avvolgere i criostampi nel cellophane e conservarli a -20 °C o -80 °C.NOTA: Per una conservazione prolungata oltre 1-2 mesi in un mezzo di crioinclusione, si consiglia una temperatura di -80 °C per evitare l’essiccazione. La criosezione assistita da nastro e l’adesione delle sezioni ai vetrini sono descritte in precedenza23. 7. Imaging sequenziale, colorazione e reimaging Implementare una procedura sequenziale di imaging, colorazione e reimaging per facilitare il rilevamento e la colocalizzazione di più segnali biologici all’interno della stessa sezione di tessuto come descritto in precedenza23. In particolare per le sezioni della cartilagine di crescita dei topi reporter con collagene tricolore, si raccomandano i seguenti passaggi. Questo approccio ordinato garantisce una visualizzazione completa sia dei segnali molecolari che dei dettagli strutturali.Inizialmente, catturare segnali fluorescenti endogeni per i tre collageni nel primo ciclo di imaging. Applicare la colorazione blu di calceina e l’immagine per il tessuto mineralizzato23, seguita dalla colorazione dell’attività enzimatica della fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP) e dall’imaging23.NOTA: Sebbene i risultati della colorazione dell’attività enzimatica TRAP non siano visualizzati qui, questa fase di colorazione viene eseguita in quanto è essenziale per la rimozione del minerale prima dei risultati della colorazione Safranin O/Fast Green presentati nella sezione dei risultati rappresentativi. Condurre la colorazione nucleare 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) come descritto di seguito e quindi l’immagine.Posizionare i vetrini che sono stati sottoposti a imaging precedente in un barattolo Coplin contenente 1x PBS. Lasciarli immersi fino a quando i vetrini coprioggetti non si staccano dai vetrini. Una volta staccati, rimuovere e asciugare accuratamente i vetrini. Applicare la soluzione controcolorante DAPI sui vetrini, utilizzando una diluizione 1:1.000 di DAPI in una miscela di glicerolo al 50% e 1x PBS. Procedere con il processo di imaging dopo l’applicazione. Concludere con l’applicazione del colorante Safranin O/Fast Green per accentuare l’architettura dei tessuti e quindi l’immagine.NOTA: Eseguire questa operazione come passaggio conclusivo per correlare le immagini cromogeniche con i segnali fluorescenti.Preparare le soluzioni di ferro ematossilina di Weigert. Preparare la soluzione A sciogliendo 1 g di ematossilina in 100 mL di etanolo al 95% e la Soluzione B combinando 4 mL di soluzione di cloruro ferrico al 29%, 95 mL di acqua deionizzata e 1 mL di HCl concentrato. Mescolare parti uguali della soluzione A e B per creare la soluzione di ematossilina funzionante di Weigert, stabile per circa 4 settimane. Immergere gli scivoli in acqua deionizzata per 2 x 2 minuti per idratarli. Applicare la soluzione di ematossilina di Weigert per 5 minuti. Lavare gli scivoli in acqua di rubinetto per 5 minuti, quindi brevemente in acqua deionizzata per 1 minuto. Colorare con soluzione Fast Green allo 0,2% (0,2 g di Fast Green FCF in 100 mL di acqua deionizzata) per 2 min. Sciacquare brevemente con acido acetico all’1% per 1 minuto. Colorare con soluzione di Safranina O allo 0,1% (0,1 g di Safranina O in 100 mL di acqua deionizzata) per 1 min. Sciacquare in acqua deionizzata fino a ottenere un colore visivamente equilibrato, circa 5 minuti. Montare i vetrini in glicerolo al 30% in acqua deionizzata (evitare la PBS) e procedere immediatamente all’imaging per prevenire la diffusione del colore dal tessuto. Per accentuare le celle della zona di riposo della cartilagine di accrescimento, condurre l’immagine con un filtro Cy5: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).