Tricolor-transgenes Mausmodell zur Untersuchung von Wachstumsfugenverletzungen

Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vor Beginn der Arbeiten vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Gesundheitszentrums der University of Connecticut genehmigt. Ein Überblick über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 1: Gliederung des Protokolls zur Schädigung der Wachstumsfuge bei dreifarbigen Kollagen-Reportermäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 1. Mauszucht und Vorbereitung auf die Operation Züchten Sie dreifarbige transgene Kollagen-Reportermäuse, die Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP und Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 exprimieren, um Welpen für die Operation zu erhalten, die 2 Wochen alt sind (± 1 Tag). Verifizieren Sie die Expression des dreifachen Transgens durch Genotypisierung eines Fragments der Schwanzspitze unter einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie nur die Mäuse, die für alle drei Farben positiv sind, um den Nutzen des Reportersystems bei der anschließenden histologischen Analyse zu maximieren.HINWEIS: Dieses Alter von 2 Wochen (± 1 Tag) wird gewählt, da sich ihre Knochenwachstumsfugen in einem ähnlichen Entwicklungsstadium befinden wie bei einem menschlichen Jugendlichen22. Dieses Protokoll gilt für beide Geschlechter von Mäusen. Identifizieren Sie am Tag der Operation oder einen Tag davor jede Maus, die für die Operation verwendet wird, mit einem Ohrstanzer, nachdem Sie das Ohr und den Ohrlocher mit alkoholischen Antiseptikum-Pads desinfiziert haben, wiegen Sie jede Maus und notieren Sie den Wert. Rasieren Sie die gesamte rechte Hintergliedmaße von der Hüfte bis zum Fuß mit einer elektrischen Haarschneidemaschine, während die Maus unter der Wirkung einer Isofluran-Anästhesie steht. Um eine Anästhesie bei Mäusen einzuleiten, verwenden Sie eine Mischung aus Isofluran (2-3%) und 100% Sauerstoff, die mit einer Flussrate von 1 l/min in einer 1-2 l Induktionskammer verabreicht wird. Entfernen Sie die Maus und vergewissern Sie sich, dass die Anästhesietiefe ausreichend ist, indem Sie die Zehen einklemmen, die nicht dazu führen sollten, dass sich die Maus bewegt.HINWEIS: Diese Narkosetiefe hält ausreichend lange an, um die Rasur durchzuführen, ohne dass ein Anästhesie-Nasenkonus erforderlich ist. Verwenden Sie Röntgenbildgebung mit einer Leistungseinstellung von 26 kV (800 mA), um Tibiabilder bei lebenden Mäusen unter Isofluran-induzierter Anästhesie aufzunehmen und die anfängliche Länge der Gliedmaßen aufzuzeichnen.Bevor Sie die Mäuse in den Röntgenschrank legen, induzieren Sie einen tiefgreifenden Anästhesiezustand mit einer Mischung aus Isofluran (2-3%) und 100% Sauerstoff, die mit einer Flussrate von 1 l/min in einer 1-2 l Induktionskammer verabreicht wird. Platzieren Sie jeweils drei anästhesierte Mäuse parallel auf dem Bauch in den Röntgenschrank in einer Regalhöhe, die es ermöglicht, ein Bild zu erhalten, das alle drei Mäuse umfasst. Spreizen Sie die Beine, damit die Schienbeinknochen nicht unter der Maus verdeckt werden. Um die Messgenauigkeit zu verbessern, positionieren Sie während der Bildgebung eine röntgendichte Skala in der Nähe der Maus (Abbildung 2A). Bringen Sie die vorbereiteten Mäuse in ihren Haltungskäfig mit der Muttermaus zurück, um auf nachfolgende chirurgische Eingriffe zu warten. 2. Vorbereitung von OP-Material und sterilem Arbeitsbereich Sterilisieren Sie die folgenden Gegenstände: 10-20 Mullpads, Applikatortupfer mit Wattespitze, Zahnbohrer (0,5 mm Durchmesser), Zahnstücke, Graefe-Pinzetten, gebogene hämostatische Mückenzangen, gebogene feine Scheren, Nadelhalter, Parodontalsonden und Zahnkleoid-Scheibenschnitzer. Sammeln Sie zusätzlich notwendige sterile Vorräte: eine injizierbare Suspension von Buprenorphin, 20 g Nadeln, 1 mL Spritzen, Handtuchabdeckungen, 5-0 ungefärbte, geflochtene, beschichtete Vicryl-Nähte, Povidon-Jod, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, alkoholische antiseptische Pads, #15 Skalpelle, OP-Handschuhe, Umweltoberflächenbarriere-Tube Sox, Augenschmiermittel, 70% Ethanol-Spray. Schalten Sie einen Glasperlensterilisator für die zusätzliche Sterilisation von Gegenständen während der Operation und das elektrische Heizkissen unter einem sauberen Mauskäfig mit sterilisierter Einstreu ein. Reinigen und sterilisieren Sie den Fluoreszenz-Stereomikroskoptisch, die angrenzenden Oberflächen und das Ständer für chirurgische Instrumente mit 70 % Ethanol. Decken Sie diese Bereiche, die zum chirurgischen Arbeitsbereich werden, mit sterilen Handtuchabdeckungen ab. Montieren Sie das elektronische Hochgeschwindigkeits-Dentalbohrsystem. Verbinden Sie den elektronischen Fußschalter mit der Steuereinheit und decken Sie das Handstückkabel mit einem desinfizierten Oberflächensperrschlauch sox ab. Befestigen Sie den sterilen 0,5 mm runden Zahnbohrer. Schalten Sie den Controller ein und stellen Sie ihn auf ein Übersetzungsverhältnis von 1:1 und maximal 30.000 U/min ein. Befestigen Sie den flexiblen Isofluran-Maschinenschlauch, der mit dem Nasenkonus endet, der mit einem desinfizierten Oberflächenbarriererohr auf dem Fluoreszenz-Stereomikroskoptisch bedeckt ist, mit Klebeband. Schalten Sie das Fluoreszenzstereomikroskop und die Zusatzgeräte ein und öffnen Sie die Bilderfassungssoftware. Abbildung 2: Wichtige Schritte des Verfahrens zur Verletzung der murinen Wachstumsfugen mit Trilinien-Fluoreszenz-Reportern. (A) Messung der Tibialänge mittels Faxitron-Röntgenbildgebung mit einem röntgendichten Lineal, das neben den Mäusen im Röntgenschrank platziert wurde. (B) Richtige Position einer anästhesierten Maus für die Operation unter einem Fluoreszenzstereomikroskop. Proximale Tibia, gekennzeichnet durch einen schwarzen Pfeil. (C) Ein Beispiel für einen Schnitt, der vorgenommen wurde, um Zugang zur Wachstumsfuge zu erhalten. (D) Fluoreszenz-Stereomikroskopie, die die hypertrophe Zone der Wachstumsfuge beleuchtet (weißer Pfeil). Die angrenzende proliferative Zone ist durch einen gelben Pfeil gekennzeichnet. (E) Helles Licht des Chirurgen, der den 0,5 mm Zahnbohrer gegen die Wachstumsfuge legt. (F) Die präzise Platzierung des Zahnbohrers wird durch Fluoreszenz-Stereomikroskopie in die hypertrophe Zone geführt. (G) Ein Beispiel für einen Salter-Harris-Typ-II-ähnlichen Wachstumsfugendefekt (weißer Pfeil). Maßstabsleisten = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 3. Verfahren zur Verletzung der proximalen Tibia-Wachstumsfuge Betäuben Sie die Maus in der Isofluran-Anästhesiekammer, indem Sie die Isoflurankonzentration auf 2-3% und die Sauerstoffflussrate auf 1 l/min einstellen. Warten Sie auf die Induktion eines tiefgreifenden Narkosezustands, der durch einen Zehenkneiftest und die Beobachtung von Atemmustern überprüft wird. Verabreichen Sie die Hälfte der verschriebenen Dosis Buprenorphin subkutan unmittelbar nach der Entnahme der Maus aus der Kammer. Die Dosierung von Buprenorphin erfolgt gemäß dem genehmigten Tierprotokoll. Tragen Sie Augenschmiermittel auf, um die Augen der Maus während der Operation vor dem Austrocknen zu schützen, und übertragen Sie die Maus in Rückenlage auf den Nasenkegel der Isofluranmaschine auf dem Stereomikroskoptisch (Abbildung 2B). Stellen Sie den Anästhesiefluss durch den Nasenkonus auf 2% und den Sauerstofffluss auf 1 l/min ein. Desinfizieren Sie die rechte Hintergliedmaße, die Beckenregion, den vorderen Aspekt der linken Hintergliedmaße und den Schwanz nacheinander mit Povidon-Jod, gefolgt von 70% Ethanol. Überprüfen Sie eine anhaltend stabile Anästhesietiefe durch einen zusätzlichen Zehenquetschtest und die Beobachtung von Atemmustern vor Beginn der Operation. Bei hellem Licht wird mit einem Skalpell #15 ein Hautschnitt direkt unterhalb des Kniegelenks mit einer Anfangslänge von ca. 5 mm erstellt, um das proximale Ende der rechten Tibia freizulegen (Abbildung 2C). Verwenden Sie bei Bedarf eine Schere, um den Schnitt zu verlängern. Halten Sie das linke kontralaterale Schienbein unverletzt, so dass es als innere unverletzte Kontrolle dient. Führen Sie eine vertikale stumpfe Dissektion durch den darüber liegenden Muskel an der proximalen Tibia mit der Rückseite des Skalpells #15 durch und entfernen Sie das Weichgewebe, um die Wachstumsfuge frei zu sehen. Schalten Sie die Beleuchtung im Operationssaal aus und wählen Sie den richtigen Fluoreszenzkanal aus, um den gewünschten Bereich der Wachstumsfuge zu beleuchten. Für die Abbildung des fluoreszierenden Kollagens werden folgende Filtersets benötigt: Col 2 Cyan: ET436/20x (Anregung), ET480/40 m (Emission), Col 10 mCherry: ET577/20x (Anregung), ET640/40 m (Emission), Col 1 Topas: ET500/20x (Anregung), ET535/30 m (Emission). Positionieren Sie die Maus so, dass sie die proximale tibiale Wachstumsfuge beobachtet (Abbildung 2D). Stellen Sie die Hautöffnung etwas proximal und dann distal ein, um sicherzustellen, dass die Tibia-Wachstumsfuge und nicht die Femur-Wachstumsfuge sichtbar ist. Erzeugen Sie eine Salter-Harris-Typ-II-ähnliche Läsion, während Sie durch das Mikroskopokular schauen, indem Sie den 0,5-mm-Dentalbohrer parallel zur Tibiaachse in der Mitte der hypertrophen Wachstumsfugenzone positionieren und dabei einen lateralen Zugang verwenden (Abbildung 2E, F). Um einen Defekt reproduzierbar zu machen, der eine Salter-Harris-Typ-II-Läsion nachahmt, halten Sie die Extremität parallel zur Arbeitsfläche, damit der Bohrereintrittsweg nicht in die Epiphyse einbiegt. Üben Sie Druck auf das Bohrpedal aus, um die Bohrerdrehung einzuleiten, und drücken Sie den Bohrer vorsichtig in die Wachstumsfuge ein, bis er stoppt, bevor der Defekt tiefer als der Bohrerdurchmesser vordringt (Abbildung 2G).HINWEIS: Ein zweites Paar Hände, das bei der Stabilisierung des Mausgliedes hilft, ist hilfreich. Spülen Sie die Läsionsstelle mit einem Tropfen sterilem PBS, um alle Ablagerungen zu entfernen. Bestätigen Sie die Tiefe des Defekts bei 0,5 mm mit einer Parodontalsonde. 4. Verfahren nach der Verletzung und Schließung Für eine Time-Zero-Defect-Charakterisierung entnehmen Sie die verletzte Hintergliedmaße und kontrollieren Sie die Extremität vor dem Gewebeverschluss. Verfolgen Sie die Gewebeentnahme und die Vorbereitung für die anschließende Mikrocomputertomographie (microCT) und die kryohistologische Bildgebung in Abschnitt 6.HINWEIS: Bei Experimenten, bei denen eine therapeutische Substanz in den Defekt der Wachstumsfuge implantiert wird, kann der Defekt selbst nur ein Stück Biomaterial aufnehmen, das ungefähr kugelförmig ist und einen Durchmesser von 0,5 mm oder ein Volumen von 0,082 mm3 (0,082 μL) hat. Verwenden Sie eine Pinzette unter mikroskopischer Visualisierung, um das Biomaterial einzuführen, oder injizieren Sie ein flüssiges Therapeutikum in den Defekt innerhalb der Wachstumsfuge. Verwenden Sie ein größeres Volumen an Biomaterial oder injizierter Substanz, wenn das Studiendesign nicht erfordert, dass das Therapeutikum nur auf den Defekt beschränkt wird. Richten Sie die Hautränder vorsichtig neu aus und stellen Sie sicher, dass das implantierte Material, falls vorhanden, sicher an der Defektstelle verbleibt. Verwenden Sie unterbrochene Nahttechniken mit 5-0-Polyglykolsäurenähten, um den Hautschnitt effektiv zu versiegeln. Reinigen Sie die Bereiche außerhalb des chirurgischen Bereichs gründlich von Povidon-Jod-Rückständen mit Tupfern mit sterilem Wasser und achten Sie darauf, den Kontakt mit der Wunde und den eng umliegenden Bereichen zu vermeiden. Nehmen Sie die Maus aus dem Isofluran-Nasenkegel auf dem Mikroskoptisch in einen Auffangkäfig und positionieren Sie sie seitlich auf frischer Einstreu über einem Heizkissen. Beobachten Sie die Atemfrequenz der Maus etwa 5 Minuten lang genau und verabreichen Sie die verbleibende Buprenorphin-Dosis zur Analgesie, genau dann, wenn die Wirkung der Isofluran-Anästhesie nachlässt, was durch eine Erhöhung der Atemfrequenz angezeigt wird, jedoch vor dem Einsetzen der Mobilität. Halten Sie die Maus in einem isolierten Auffangkäfig, bis sie ihre vollen Gehfähigkeiten unter Beweis stellt, und vereinen Sie sie danach wieder mit ihrer Mutter und ihren Geschwistern. Führen Sie in den ersten 48 Stunden nach der Operation tägliche Inspektionen durch, gefolgt von wöchentlichen Beurteilungen bis zur Euthanasie. Konzentrieren Sie sich auf Anzeichen von Infektionen, die Wirksamkeit der Fortbewegung, den Zugang zu Lebensmitteln und die Integrität der Nähte. Entwöhnen Sie die Mäuse zur Standardzeit (d. h. im Alter von 3 Wochen). 5. Messungen der Gliedmaßenlänge Basierend auf den durch die experimentelle Hypothese und das Versuchsdesign bestimmten Zeitpunkten wird die Maus mit Isofluran anästhesiert und eine Röntgenbildgebung der gesamten Länge der verletzten und unverletzten Tibien durchgeführt, wie in Abbildung 2A gezeigt und in Abschnitt 1.4 beschrieben. Geeignete Orientierungspunkte für konsistente Messungen der Gliedmaßenlänge sind die Oberseite der Tibiaepiphyse und das distale Ende der Tibia am Tibiotalargelenk, wie in Abbildung 3 gezeigt.HINWEIS: Die Bildgebung wird verwendet, um die Diskrepanzen zwischen der Gliedmaßenlänge und der Gliedmaßenlänge aufgrund der Verletzung sowie die Entwicklung der knöchernen Brücke innerhalb des Wachstumsfugengewebes in bestimmten postoperativen Intervallen zu beurteilen. 6. Gewebedissektion, Fixierung, Mikro-CT-Bildgebung und Einbettung Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung, vorzugsweise unter Verwendung eines automatisierten CO2 – Induktionssystems mit einer Bestätigung des Todes durch eine alternative Methode, wie z. B. eine Zervixluxation. Isolieren Sie beide intakten Hintergliedmaßen und entfernen Sie Haut und Muskeln aus dem Knochen- und Kniekapselbereich zur Vorbereitung auf die histologische und mikroCT-Analyse.Bevor Sie die hinteren Gliedmaßen in das Fixiermittel stecken, entfernen Sie die Patella vorsichtig, indem Sie sie mit einer Mikropräparierschere abschneiden, um das Eindringen des Fixiermittels in die Kniehöhle zu erleichtern. Verwenden Sie eine 29-G-Insulinspritze, um kaltes 10% gepuffertes Formalin gründlich in allen Bereichen der Kniehöhle zu verteilen. Verstärken Sie die diaphysäre Region des Femurs und der Tibia, um den fixativen Zugang zum Knochenmarkraum zu verbessern. Halten Sie das Gelenkgewebe für 24-36 h bei 4 °C in einer vollständig ausgestreckten Position im Fixiermittel, indem Sie es mit Gaze an einen dünnen Dübel binden.ACHTUNG: Formalin ist giftig und sollte in einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden. Nach 24-48 Stunden Formalinfixierung bei 4 °C ist eine hochauflösende Röntgen-Mikro-CT von kontralateralen und verletzten Proben mittels Mikro-CT-Bildgebung durchzuführen, nachdem die Proben an PBS übertragen wurden, um die Entwicklung der knöchernen Brücke zu beurteilen. Verwenden Sie eine Voxelgröße von 6,0 μm, Abtastzeiten von 330.000 ms und Energieeinstellungen von 55.000 V bei einer Intensität von 145 μA. Nach der mikroCT-Bildgebung und weiteren 24 Stunden Formalinfixierung bei 4 °C spülen Sie die Proben 3 x 5 Minuten lang in 1x PBS und tauchen Sie die Proben dann 1 h lang in 10 % Saccharose in 1x PBS, 1 h lang 20 % Saccharose in 1x PBS und über Nacht 30 % Saccharose in 1 x PBS. Verwenden Sie eine mit Saccharoselösung gefüllte 29-G-Insulinspritze, um sicherzustellen, dass die Saccharoselösung alle Regionen der Kniehöhle durchdringt. In einen -80 °C-Gefrierschrank umfüllen, wenn nach dem Eintauchen der Saccharose über Nacht keine Einbettung erfolgt, um die Beibehaltung des GFP-Reporters und der enzymatischen Aktivität des Gewebes zu gewährleisten. Entfernen Sie vor dem Einbetten jegliches restliches Muskelgewebe aus der Gelenkregion. Äquilibrieren Sie die Probe über Nacht mit einem Kryo-Einbettungsmedium, um das Eindringen des Mediums in die Kniehöhle zu erleichtern. Sehen Sie sich die microCT-Bilder an, um vor der Einbettung zu bestimmen, wo sich der Defekt und die knöcherne Brücke befinden. Tragen Sie eine dünne Schicht des Kryo-Einbettungsmediums in ein Kryomold auf und platzieren Sie das präparierte und noch verbundene Schienbein/Oberschenkel/Gelenk so, dass der interessierende Bereich 90° zur Oberfläche des Einbettungsmediums zeigt.HINWEIS: Diese Ausrichtung ermöglicht es dem Schnitt, die Queransicht des seitlich erzeugten Defekts zu erfassen. Wenn sich die knöcherne Brücke in der Nähe des Randes des Defekts befindet, wird durch diese Ausrichtung auch die Möglichkeit vermieden, dass der interessierende Bereich bei den ersten dickeren Schnitten durch das Gewebe übersehen wird. Positionieren Sie die Kryoform auf Trockeneis, bis das Kryo-Einbettungsmedium erstarrt ist und die Probe gesichert ist. Füllen Sie die Kryoform weiter mit dem Medium, während Sie sie auf Trockeneis halten. Nachdem Sie die Probe gesichert haben, tauchen Sie das Kryomold in 2-Methyl-Butan, das mit Trockeneis gekühlt wurde, bis es vollständig gefroren ist. Nach dem Einfrieren überschüssiges 2-Methyl-Butan entfernen, die Kryoformen in Zellophan einwickeln und bei -20 °C oder -80 °C lagern.HINWEIS: Für eine längere Lagerung von mehr als 1-2 Monaten in einem Kryo-Einbettungsmedium wird eine Temperatur von -80 °C empfohlen, um ein Austrocknen zu verhindern. Die bandgestützte Kryosektion und die Verklebung der Schnitte auf den Objektträgern sind zuvor beschrieben23. 7. Sequentielle Bildgebung, Färbung und Reimaging Implementierung eines sequentiellen Verfahrens der Bildgebung, Färbung und erneuten Bildgebung, um die Erkennung und Kolokalisierung mehrerer biologischer Signale innerhalb desselben Gewebeschnitts zu erleichtern, wie zuvor beschrieben23. Speziell für die Wachstumsfugenschnitte der dreifarbigen Kollagen-Reportermäuse werden die folgenden Schritte empfohlen. Dieser geordnete Ansatz gewährleistet eine umfassende Visualisierung sowohl molekularer Signale als auch struktureller Details.Erfassen Sie zunächst endogene Fluoreszenzsignale für die drei Kollagene in der ersten Bildgebungsrunde. Wenden Sie eine Calceinblau-Färbung und ein Bild für mineralisiertes Gewebe23 an, gefolgt von der Färbung und Bildgebung der enzymatischen Aktivität der tartratresistenten sauren Phosphatase (TRAP) (TRAP)23.HINWEIS: Obwohl die Färbeergebnisse der enzymatischen Aktivität von TRAP hier nicht angezeigt werden, wird dieser Färbeschritt durchgeführt, da er für die Entfernung von Mineralien vor den im Abschnitt “Repräsentative Ergebnisse” dargestellten Färbeergebnissen von Safranin O/Fast Green unerlässlich ist. Führen Sie eine 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Kernfärbung wie unten beschrieben durch und dann ein Bild.Legen Sie Objektträger, die zuvor fotografiert wurden, in ein Coplin-Glas mit 1x PBS. Lassen Sie sie untergetaucht, bis sich die Deckgläser von den Objektträgern lösen. Nach dem Lösen die Deckgläser entfernen und gründlich trocknen. Tragen Sie DAPI Gegenfärbelösung auf die Deckgläser auf, wobei Sie eine 1:1.000-Verdünnung von DAPI in einer Mischung aus 50 % Glycerin und 1x PBS verwenden. Fahren Sie nach der Anwendung mit dem Imaging-Prozess fort. Zum Schluss tragen Sie Safranin O/Fast Green Färbung auf, um die Gewebearchitektur zu betonen und dann das Bild zu gestalten.HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt als letzten Schritt aus, um chromogene Bilder mit Fluoreszenzsignalen zu korrelieren.Bereiten Sie Weigert’s Eisen-Hämatoxylin-Lösungen vor. Bereiten Sie Lösung A vor, indem Sie 1 g Hämatoxylin in 100 ml 95%igem Ethanol auflösen, und Lösung B durch Kombinieren von 4 ml 29%iger Eisenchloridlösung, 95 ml deionisiertem Wasser und 1 ml konzentriertem HCl. Mischen Sie gleiche Teile von Lösung A und B, um die Weigert’sche Arbeitshämatoxylinlösung herzustellen, die etwa 4 Wochen lang stabil ist. Tauchen Sie die Objektträger 2 x 2 Minuten lang in entionisiertes Wasser, um sie zu hydratisieren. Tragen Sie die Hämatoxylin-Arbeitslösung von Weigert 5 Minuten lang auf. Objektträger 5 min in Leitungswasser waschen, danach 1 min kurz in entionisiertem Wasser. Mit 0,2 % Fast Green Lösung (0,2 g Fast Green FCF in 100 mL entionisiertem Wasser) für 2 min färben. 1 min kurz in 1%iger Essigsäure spülen. Mit 0,1 % Safranin O-Lösung (0,1 g Safranin O in 100 mL entionisiertem Wasser) 1 min lang färben. In entionisiertem Wasser spülen, bis eine visuell ausgewogene Farbe erreicht ist, ca. 5 Minuten. Montieren Sie Objektträger in 30 % Glycerin in entionisiertem Wasser (vermeiden Sie PBS) und fahren Sie sofort mit der Bildgebung fort, um eine Farbdiffusion aus dem Gewebe zu verhindern. Zur Akzentuierung der Ruhezonenzellen der Wachstumsfuge führen Sie das Bild mit einem Cy5-Filter durch: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).