מודל מורין מהונדס טריקולור לחקר פגיעה בלוחיות גדילה

המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיים. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מרכז הבריאות של אוניברסיטת קונטיקט (IACUC) לפני תחילת העבודה. מתווה של הפרוטוקול מתואר בסכמה של איור 1 . איור 1: מתאר פרוטוקול הפגיעה בלוחיות גדילה בעכברי טריקולור קולגן ריפורטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 1. גידול עכברים והכנה לניתוח גזע עכברי קולגן מהונדס טריקולור המבטאים Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP ו- Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 לכל הליכי גידול סטנדרטיים להשגת גורים לניתוח בני שבועיים (± יום). אמת את ביטוי הטרנסגן המשולש על ידי גנוטיפ של מקטע קצה זנב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש רק בעכברים החיוביים לכל שלושת הצבעים כדי למקסם את היתרון של מערכת הכתב במהלך ניתוח היסטולוגי עוקב.הערה: גיל זה של 2 שבועות (± 1 יום) נבחר כי לוחיות צמיחת העצם שלהם נמצאים בשלב דומה של התפתחות המתבגר האנושי22. פרוטוקול זה חל על שני המינים של עכברים. ביום הניתוח או יום לפניו, יש לזהות באופן ייחודי כל עכבר המשמש לניתוח באמצעות ניקוב אוזניים לאחר חיטוי האוזן ואגרוף האוזן באמצעות רפידות חיטוי אלכוהוליות, לשקול כל עכבר ולרשום את הערך. יש לגלח את כל הגפה האחורית הימנית מהירך ועד כף הרגל באמצעות קוצץ חשמלי בזמן שהעכבר נמצא תחת השפעת הרדמה איזופלורנית. כדי לגרום להרדמה בעכברים, יש להשתמש בתערובת של איזופלורן (2-3%) ו-100% חמצן, הניתנת בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה בתוך תא אינדוקציה של 1-2 ליטר. הסר את העכבר וודא שעומק ההרדמה מספיק עם צביטת בוהן שלא אמורה לגרום לעכבר לזוז.הערה: עומק זה של הרדמה יחזיק מעמד מספיק זמן כדי לבצע את הגילוח ללא צורך בקונוס אף בהרדמה. השתמש בהדמיית רנטגן עם הגדרת הספק של 26 kV (800 mA) כדי ללכוד תמונות טיביאליות בעכברים חיים תחת הרדמה הנגרמת על ידי איזופלורן כדי להקליט את אורך הגפיים הראשוני.לפני הכנסת העכברים לארון הרנטגן, יש לבצע הרדמה עמוקה באמצעות תערובת של איזופלורן (2-3%) ו-100% חמצן, הניתנת בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה בתוך תא אינדוקציה של 1-2 ליטר. הניחו שלושה עכברים מורדמים במקביל על קיבתם בארון הרנטגן בגובה מדף המאפשר קבלת תמונה אחת הכוללת את כל שלושת העכברים. שחקו את הרגליים כך שהעצמות הטיביאליות לא יוסתרו מתחת לעכבר. לקבלת דיוק מדידה משופר, מקם סולם רדיופאק ליד העכבר במהלך הדמיה (איור 2A). החזירו את העכברים המוכנים לכלוב הדיור שלהם עם עכבר האם כדי להמתין להליכים הכירורגיים הבאים. 2. הכנת ציוד כירורגי ואזור עבודה סטרילי לעקר את הפריטים הבאים: 10-20 רפידות גזה, מקלוני מוליך כותנה, בורות שיניים (בקוטר 0.5 מ”מ), חתיכות שיניים, מלקחיים Graefe, מלקחיים המוסטטיים יתושים מעוקלים, מספריים עדינים מעוקלים, מחזיקי מחטים, בדיקות חניכיים, וגילופי דיסקואידים דנטליים. אסוף אספקה סטרילית נחוצה נוספת: תרחיף להזרקה של buprenorphine, 20 G מחטים, מזרקים 1 מ”ל, וילונות מגבות, 5-0 לא צבוע, קלוע, מצופה, תפרים vicryl, povidone-יוד, מלוחים חוצצים פוספט, רפידות חיטוי אלכוהול, # 15 אזמלים, כפפות כירורגיות, צינור מחסום פני השטח הסביבתי, חומר סיכה לעיניים, תרסיס אתנול 70%. הפעל מעקר חרוזי זכוכית לעיקור נוסף של פריטים במהלך הניתוח וכרית חימום חשמלית מתחת לכלוב עכבר נקי עם מצעים מעוקרים. נקו ועיקרו את שלב המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, את המשטחים הסמוכים ואת מעמד מכשיר הניתוח באמצעות 70% אתנול. כסו אזורים אלה שיהפכו לסביבת העבודה הכירורגית בוילונות מגבות סטריליים. הרכיבו את מערכת הקידוח הדנטלי האלקטרונית במהירות גבוהה. חבר את בקר כף הרגל האלקטרוני ליחידת הבקרה וכסה את כבל הידית בצינור מחסום משטח שעבר חיטוי. חבר את בור השיניים העגול הסטרילי בקוטר 0.5 מ”מ. הפעל את הבקר והגדר אותו ליחס הנעה של 1:1 ולכל היותר 30,000 סל”ד. אבטח, בעזרת נייר דבק, את צינור מכונת האיזופלורן הגמיש המסתיים כשחרוט האף מכוסה בצינור מחסום משטח שעבר חיטוי על במת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. הפעל את הסטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי ואת הציוד הנלווה ופתח את תוכנת רכישת התמונה. איור 2: שלבים עיקריים בהליך הפציעה של לוחית הגידול של הכתב הפלואורסצנטי התלת-שושלת. (A) מדידת אורך טיביאלי באמצעות הדמיית רנטגן של פקסיטרון באמצעות סרגל רדיופאק המונח לצד העכברים בארון הרנטגן. (B) מיקום תקין של עכבר מורדם לניתוח תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טיביה פרוקסימלית מסומנת על ידי חץ שחור. (C) דוגמה לחתך שנעשה כדי לגשת ללוחית הצמיחה. (D) מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי המאיר את האזור ההיפרטרופי של לוח הגידול (חץ לבן). אזור ההתרבות הסמוך מסומן על ידי חץ צהוב. (E) תאורת אור בהירה של המנתח המניח את בור השיניים בקוטר 0.5 מ”מ כנגד לוחית הצמיחה. (F) מיקום מדויק של בור השיניים מונחה על ידי מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי לאזור ההיפרטרופי. (G) דוגמה לפגם בלוח גדילה מסוג Salter-Harris Type II (חץ לבן). פסי קנה מידה = 1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 3. הליך פציעה של לוחית גידול טיביה פרוקסימלית מרדימים את העכבר בתא ההרדמה איזופלורן, מכוונים את ריכוז האיזופלורן ל-2-3% ואת קצב זרימת החמצן ל-1 ליטר/דקה. ממתינים להשראת מצב הרדמה עמוק, מאומת על ידי בדיקת צביטת בוהן ותצפית על דפוסי נשימה. לנהל מחצית המינון שנקבע של buprenorphine תת עורית מיד לאחר הסרת העכבר מן החדר. המינון של buprenorphine הוא בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים מאושר. מרחו חומר סיכה עיני כדי להגן על עיני העכבר מפני התייבשות במהלך הניתוח, והעבירו את העכבר במצב שכיבה לחרוט האף של מכונת האיזופלורן בשלב הסטריאומיקרוסקופ (איור 2B). התאימו את זרימת ההרדמה דרך חרוט האף ל-2% ואת קצב זרימת החמצן ל-1 ליטר/דקה. יש לחטא את הגפה האחורית הימנית, אזור האגן, האספקט הקדמי של הגפה האחורית השמאלית והזנב ברצף עם פובידון-יוד ואחריו 70% אתנול. יש לוודא המשך עומק יציב של הרדמה באמצעות בדיקת צביטת בוהן נוספת ותצפית על דפוסי הנשימה לפני תחילת הניתוח. תחת תאורת אור בהירה, השתמשו באזמל #15 כדי ליצור חתך בעור ממש מתחת למפרק הברך באורך התחלתי של כ-5 מ”מ, כדי לחשוף את הקצה הפרוקסימלי של השוקה הימנית (איור 2C). השתמש מספריים כדי להאריך את החיתוך במידת הצורך. שמור על השוקה הנגדית השמאלית ללא פגע כך שתשמש כבקרה פנימית ללא פגיעה. בצע דיסקציה קהה אנכית דרך השריר העליון בשוקה הפרוקסימלית באמצעות הצד האחורי של אזמל #15, הסרת הרקמה הרכה לחשיפה ברורה של צלחת הצמיחה. כבו את אורות חדר הניתוח ובחרו את תעלת הפלואורסצנטיות הנכונה כדי להאיר את האזור הרצוי של לוחית הגידול. ערכות המסננים הדרושות כדי לצלם כל קולגן פלואורסצנטי הן Col 2 ציאן: ET436/20x (עירור), ET480/40 m (פליטה), Col 10 mCherry: ET577/20x (עירור), ET640/40 m (פליטה), Col 1 Topaz: ET500/20x (עירור), ET535/30 m (פליטה). מקמו את העכבר כך שיתבונן בלוח הגדילה הטיביאלי הפרוקסימלי (איור 2D). כוונן את פתח העור מעט יותר פרוקסימלי ולאחר מכן, דיסטלי כדי לוודא שלוח הגידול הטיביאלי נמצא בתצוגה ולא לוחית צמיחת עצם הירך. צרו נגע דמוי סולטר-האריס מסוג II תוך כדי התבוננות דרך עינית המיקרוסקופ על-ידי מיקום מקדח השיניים בקוטר 0.5 מ”מ במקביל לציר הטיביאלי באמצע אזור לוחית הגידול ההיפרטרופית, תוך שימוש בגישה רוחבית (איור 2E,F). כדי ליצור פגם המחקה נגע מסוג סולטר-האריס מסוג II, יש לשמור על הגפה מקבילה למשטח העבודה, כך שמסלול הכניסה לבור לא יתנגש באפיפיזה. הפעילו לחץ על דוושת המקדחה כדי להתחיל סיבוב בור, ולחצו בעדינות על הבור לתוך לוחית הגדילה לפני שהפגם נכנס עמוק יותר מקוטר הבור (איור 2G).הערה: זוג ידיים שני המסייע בייצוב איבר העכבר מועיל. השקו את אתר הנגע בטיפת PBS סטרילית כדי להסיר לכלוך. יש לוודא את עומק הפגם ב-0.5 מ”מ באמצעות בדיקת חניכיים. 4. הליכים לאחר פציעה וסגירה לאפיון פגם אפס זמן, יש לקצור את הגפה האחורית הפגועה ולשלוט באיבר לפני סגירת הרקמות. עקוב אחר קצירת הרקמה וההכנה לטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת עוקבת (microCT) והדמיית קריו-היסטולוגיה בסעיף 6.הערה: בניסויים הכוללים השתלת חומר טיפולי בפגם בלוח הגדילה, הפגם עצמו יכול להכיל רק פיסת חומר ביולוגי שהיא בערך כדורית וקוטר 0.5 מ”מ או 0.082 מ”מ3 (0.082 μL) בנפח. השתמש במלקחיים תחת הדמיה מיקרוסקופית כדי להחדיר את החומר הביולוגי או להזריק טיפול נוזלי לתוך הפגם בתוך צלחת הגידול. השתמש בנפח גדול יותר של חומר ביולוגי או חומר מוזרק אם תכנון המחקר אינו דורש שהטיפול יוגבל רק לפגם. יישרו בזהירות מחדש את קצוות העור, וודאו שהחומר המושתל, אם בכלל, נשאר בטוח בתוך אתר הפגם. השתמש בטכניקות תפירה קטועות עם 5-0 תפרים של חומצה פוליגליקולית כדי לאטום את החתך בעור ביעילות. לנקות ביסודיות את האזורים שמעבר לאזור הכירורגי של שאריות פובידון-יוד באמצעות מטושים עם מים סטריליים, החלת זהירות כדי למנוע מגע עם הפצע ואזורים קרובים. מוציאים את העכבר מחרוט האף האיזופלורני בשלב המיקרוסקופ לכלוב התאוששות, ומניחים אותו לרוחב על מצעים טריים מעל כרית חימום. התבונן מקרוב בקצב הנשימה של העכבר במשך כ -5 דקות, מתן מינון buprenorphine הנותר עבור שיכוך כאבים בדיוק כמו ההשפעות של הרדמה isoflurane פוחתת, מסומן על ידי עלייה בקצב הנשימה, אבל לפני תחילת הניידות. החזיקו את העכבר בכלוב התאוששות מבודד עד שיפגין יכולות אמבולטוריות מלאות, ולאחר מכן יאחדו אותו עם אמו ואחיו. בצע בדיקות יומיות במשך 48 השעות הראשונות לאחר הניתוח, ולאחר מכן הערכות שבועיות עד לנקודה של המתת חסד. דגש על סימני זיהום, יעילות תנועה, נגישות למזון ותקינות התפרים. לגמול את העכברים בזמן הסטנדרטי (כלומר, 3 שבועות של גיל). 5. מדידות אורך גפיים בהתבסס על נקודות הזמן שנקבעו על-ידי השערת הניסוי ותכנונו, הרדימו את העכברים באמצעות איזופלורן ובצעו הדמיית רנטגן לכל אורכה של עצם השוקה הפגועה והלא פצועה, כפי שמוצג באיור 2A ומתואר בסעיף 1.4. ציוני דרך מתאימים לביצוע מדידות עקביות של אורך הגפיים כוללים את החלק העליון של האפיפיזה הטיביאלית ואת הקצה הדיסטלי של השוקה במפרק הטיביוטלרי כפי שמוצג באיור 3.הערה: הדמיה משמשת להערכת פערים באורך הגפיים ובאורך הגפיים עקב הפציעה, כמו גם התפתחות הגשר הגרמי בתוך רקמות לוחית הצמיחה במרווחי זמן ספציפיים לאחר הניתוח. 6. דיסקציה של רקמות, קיבוע, הדמיית microCT והטבעה יש להרדים את העכבר באמצעות חנקCO2 , רצוי באמצעות מערכת אינדוקציה אוטומטית של CO2 עם אישור מוות בשיטה חלופית כגון פריקת צוואר הרחם. בודדו את שתי הגפיים האחוריות השלמות והסירו עור ושרירים מאזור הקופסית של העצם והברך כהכנה לניתוח היסטולוגי ומיקרו-CT.לפני הכנסת הגפיים האחוריות לתוך הקיבוע, הבלו את הפטלה בזהירות על ידי חיתוך שלה באמצעות מספריים מיקרו לנתח כדי להקל על חדירה קיבוע לתוך חלל הברך. השתמשו במזרק אינסולין 29 גרם לפיזור יסודי של פורמלין קר 10% חוצץ בכל אזורי חלל הברך. חמור האזור diaphyseal של עצם הירך ואת השוקה כדי לשפר את הגישה קיבוע לחלל המח. שמור על רקמת המפרק במצב מורחב לחלוטין בתוך קיבוע במשך 24-36 שעות ב 4 ° C על ידי קשירת אותו עם גזה למגבת דקה.אזהרה: פורמלין הוא רעיל ויש לטפל בו במכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים. לאחר 24-48 שעות של קיבוע פורמלין ב -4 מעלות צלזיוס, בצע מיקרו-CT רנטגן ברזולוציה גבוהה של דגימות קונטרלטרליות ופגועות על ידי הדמיית microCT לאחר העברת דגימות ל- PBS, להערכת התפתחות גשר גרמי. השתמש בגודל ווקסל של 6.0 מיקרומטר, זמני דגימה של 330,000 אלפיות השנייה, והגדרות אנרגיה של 55,000 וולט בעוצמה של 145 μA. לאחר הדמיית microCT ו-24 שעות נוספות של קיבוע פורמלין ב-4°C, שטפו את הדגימות ב-1X PBS במשך 3X5 דקות ולאחר מכן, טבלו את הדגימות ב-10% סוכרוז ב-1X PBS למשך שעה אחת, 20% סוכרוז ב-1X PBS למשך שעה אחת, ו-30% סוכרוז ב-1X PBS למשך הלילה. השתמשו במזרק אינסולין 29 גרם מלא בתמיסת סוכרוז כדי להבטיח שתמיסת הסוכרוז תחלחל לכל אזורי חלל הברך. מעבירים למקפיא בטמפרטורה של -80°C אם לא מטמיעים לאחר טבילת הסוכרוז למשך הלילה, כדי להבטיח שמירה על כתב GFP ופעילות אנזימטית של רקמות. הסר כל רקמת שריר שארית מאזור המפרק לפני ההטבעה. אזנו את הדגימה עם מדיום הטבעה בהקפאה למשך הלילה, מה שמקל על חדירה בינונית לחלל הברך. צפה בתמונות ה- microCT כדי לקבוע היכן ממוקמים הפגם והגשר הגרמי לפני ההטבעה. יש למרוח שכבה דקה של תווך ההטבעה הקריו-קריו-טבועה לתוך קריומולד ולמקם את השוקה/עצם הירך/מפרק המנותחים והמחוברים עדיין, כך שאזור העניין פונה ב-90° לפני השטח של תווך ההטבעה.הערה: כיוון זה מאפשר לחתך ללכוד את התצוגה הרוחבית של הפגם שנוצר לרוחב. אם הגשר הגרמי קרוב לקצה הפגם, אז כיוון זה גם ימנע את האפשרות להחמיץ את אזור העניין במהלך החלקים העבים הראשונים שנלקחו דרך הרקמה. הניחו את הקריומולד על קרח יבש עד שמדיום ההטבעה בהקפאה יתמצק, ויאבטח את הדגימה. המשיכו למלא את הקריומולד במדיום תוך שמירה על קרח יבש. לאחר אבטחת הדגימה, טבלו את הקריומולד ב-2-מתיל-בוטאן מקורר בקרח יבש עד להקפאה מלאה. לאחר ההקפאה, הסירו עודפי 2-מתיל-בוטאן, עטפו את הקריומולדים בצלופן, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C או -80°C.הערה: לאחסון ממושך מעבר לחודש-חודשיים בתווך הטבעה בהקפאה, מומלץ -80°C כדי למנוע התייבשות. הקפאה בסיוע סרט והדבקה של הקטעים לשקופיות הזכוכית מתוארים קודם לכן23. 7. הדמיה רציפה, צביעה והדמיה מחדש ליישם הליך רציף של הדמיה, צביעה והדמיה מחדש כדי להקל על זיהוי וקולוקליזציה של אותות ביולוגיים מרובים באותו קטע רקמה כפי שתואר קודם לכן23. באופן ספציפי עבור חלקי לוחית הגדילה של עכברי טריקולור קולגן ריפורטר, מומלץ לבצע את השלבים הבאים. גישה מסודרת זו מבטיחה הדמיה מקיפה הן של אותות מולקולריים והן של פרטים מבניים.בתחילה, לכוד אותות פלואורסצנטיים אנדוגניים עבור שלושת הקולגן בסבב הראשון של ההדמיה. החל צביעה כחולה calcein ותמונה עבור רקמה מינרלית23, ואחריו חומצה phosphatase עמיד tartrate (TRAP) פעילות אנזימטית צביעה והדמיה23.הערה: בעוד שתוצאות צביעת הפעילות האנזימטית של TRAP אינן מוצגות כאן, שלב צביעה זה מבוצע מכיוון שהוא חיוני להסרת מינרלים לפני תוצאות הצביעה של ספרנין O/Fast Green המוצגות בסעיף התוצאות המייצגות. בצע צביעה גרעינית 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כמתואר להלן ולאחר מכן תמונה.הכניסו שקופיות שעברו הדמיה קודמת לצנצנת קופלין המכילה 1x PBS. השאירו אותם שקועים עד שהכיסויים יתנתקו מהמגלשות. לאחר הניתוק, יש להסיר ולייבש היטב את הכיסויים. יש למרוח תמיסת צביעה נגדית מסוג DAPI על החלקות הכיסוי, תוך שימוש בדילול של DAPI ביחס של 1:1,000 בתערובת של 50% גליצרול ו-1x PBS. המשך בתהליך ההדמיה לאחר היישום. סיימו עם היישום של Safranin O/Fast Green Stain כדי להדגיש את ארכיטקטורת הרקמה ולאחר מכן תמונה.הערה: בצע זאת כשלב המסכם כדי להתאים תמונות כרומוגניות לאותות פלואורסצנטיים.הכינו את תמיסות המטוקסילין ברזל של וייגרט. הכינו תמיסה A על ידי המסת 1 גרם של hematoxylin ב 100 מ”ל של 95% אתנול ותמיסה B על ידי שילוב של 4 מ”ל של 29% תמיסת ברזל כלורי, 95 מ”ל של מים נטולי יונים, ו 1 מ”ל של HCl מרוכז. ערבבו חלקים שווים של תמיסה A ו-B כדי ליצור את תמיסת המטוקסילין העובדת של וייגרט, יציבה למשך כ-4 שבועות. יש לטבול את המגלשות במים נטולי יונים, למשך 2X2 דקות כדי להתייבש. מרחו את תמיסת המטוקסילין העובדת של Weigert למשך 5 דקות. שטפו את המגלשות במי ברז במשך 5 דקות, ולאחר מכן לזמן קצר במים נטולי יונים, למשך דקה אחת. יש לצבוע בתמיסה ירוקה מהירה 0.2% (0.2 גרם FCF ירוק מהיר ב-100 מ”ל מים נטולי יונים) למשך 2 דקות. יש לשטוף בקצרה בחומצה אצטית 1% למשך דקה אחת. מכתים עם תמיסת 0.1% ספרנין O (0.1 גרם ספרנין O ב-100 מ”ל מים נטולי יונים) למשך דקה אחת. יש לשטוף במים נטולי יונים, עד לקבלת צבע מאוזן ויזואלית, כ-5 דקות. הרכיבו מחליקים ב-30% גליצרול במים שעברו דה-יוניזציה (הימנעו מ-PBS) והמשיכו מיד להדמיה כדי למנוע פיזור צבע מהרקמה. כדי להדגיש את תאי אזור המנוחה של לוחית הגדילה תמונת מוליך עם מסנן Cy5: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).