دراسة الخلايا البطانية الدهنية / الخلايا الشحمية في الأنسجة الدهنية تحت الجلد البشرية
Summary
هنا ، نصف بروتوكولا لعزل الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة وزراعتها وتنميطها الظاهري من الأنسجة الدهنية البشرية تحت الجلد (hSATMVECs). بالإضافة إلى ذلك ، وصفنا نموذجا تجريبيا للحديث المتقاطع للخلايا الشحمية hSATMVEC.
Abstract
تلعب الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة (MVECs) العديد من الأدوار الحاسمة ، بما في ذلك التحكم في نغمة الأوعية الدموية ، وتنظيم تجلط الدم ، وتكوين الأوعية. يعتمد عدم التجانس الكبير في النمط الجيني للخلايا البطانية (EC) والنمط الظاهري على السرير الوعائي وحالة المرض المضيف. توفر القدرة على عزل MVECs من أسرة الأوعية الدموية الخاصة بالأنسجة ومجموعات المرضى الفردية الفرصة لمقارنة وظيفة MVEC مباشرة في حالات مرضية مختلفة. هنا ، باستخدام الأنسجة الدهنية تحت الجلد (SAT) التي تم التقاطها في وقت إدخال الأجهزة الإلكترونية القابلة للزرع القلبية (CIED) ، وصفنا طريقة لعزل مجموعة نقية من الأنسجة الدهنية البشرية تحت الجلد الوظيفية MVEC (hSATMVEC) ونموذج تجريبي للحديث المتقاطع hSATMVEC-adipocyte.
تم عزل hSATMVEC بعد الهضم الأنزيمي ل SAT عن طريق الحضانة باستخدام حبات مغناطيسية مغلفة بالأجسام المضادة CD31 والمرور عبر الأعمدة المغناطيسية. تم زراعة hSATMVEC وتمريرها على ألواح مغلفة بالجيلاتين. استخدمت التجارب الخلايا في الممرات 2-4. حافظت الخلايا على السمات الكلاسيكية لمورفولوجيا EC حتى المقطع 5 على الأقل. أظهر تقييم قياس التدفق الخلوي نقاء 99.5٪ من hSATMVEC المعزول ، والذي تم تعريفه على أنه CD31 + / CD144 + / CD45–. كان وقت تضاعف عدد hSATMVEC المعزول من الضوابط حوالي 57 ساعة ، وتم تأكيد الانتشار النشط باستخدام مجموعة تصوير تكاثر الخلايا. تم تقييم وظيفة hSATMVEC المعزولة باستخدام استجابتها لتحفيز الأنسولين وإمكانية تكوين أنبوب وعائي. ثم أنشأنا نموذج زراعة الخلايا الشحمية تحت الجلد hSATMVEC لدراسة الحديث الخلوي وأظهرنا تأثير المصب ل hSATMVEC على وظيفة الخلايا الشحمية.
يمكن عزل hSATMVEC من SAT المأخوذ في وقت إدخال CIED وهو ذو نقاء كاف لكل من النمط الظاهري التجريبي ودراسة الحديث المتقاطع للخلايا الشحمية hSATMVEC.
Introduction
الخلايا البطانية (ECs) هي خلايا حرشفية تبطن السطح الداخلي لجدار الأوعية الدموية كطبقة أحادية. لديهم العديد من الأدوار الأساسية ، بما في ذلك التحكم في لهجة الأوعية الدموية ، وتنظيم تجلط الدم ، وتعديل الاستجابة الالتهابية ، والمساهمة في تكوين الأوعية1. نظرا لأهمية الخلايا البطانية في فسيولوجيا القلب والأوعية الدموية ، فإنها تستخدم بشكل متكرر تجريبيا لتعزيز فهم الفيزيولوجيا المرضية وفحص العلاجات الدوائية الجديدة لأمراض القلب والأوعية الدموية.
ومع ذلك ، هناك عدم تجانس هائل في مورفولوجيا الخلايا البطانية ، والوظيفة ، والتعبير الجيني ، وتكوين المستضد اعتمادا على أصل السرير الوعائي2. في حين أن الخلايا البطانية من الشرايين الكبيرة هي الأنسب لدراسات تصلب الشرايين ، فإن الخلايا البطانية من الأوعية الصغيرة ، والمعروفة باسم الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة (MVECs) ، هي أكثر ملاءمة لدراسات تكوين الأوعيةالدموية 2. قد يوفر فهم الأساس الجزيئي لعدم التجانس البطاني رؤى قيمة حول العلاجات الخاصة بالسرير الوعائي. تختلف وظيفة بطانة الأوعية الدموية الدقيقة أيضا بشكل كبير في العديد من الأمراض ، بما في ذلك مرض السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والعدوى الجهازية 3,4. لذلك ، فإن القدرة على عزل الخلايا البطانية من مجموعات محددة من المرضى تسمح بإجراء مقارنة مباشرة لوظيفة الخلايا البطانية والحديث الخلوي5.
في هذه الورقة ، وصفنا طريقة جديدة لعزل MVECs البشرية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد (hSATMVEC) التي تم أخذها في وقت إدخال الجهاز الإلكتروني القابل للزرع في القلب (CIED). تم عزل hSATMVEC بعد الهضم الأنزيمي للأنسجة الدهنية تحت الجلد (SAT) وتمريرها على ألواح مغلفة بالجيلاتين. ثم نصف مجموعة من فحوصات التنميط الظاهري التي تم تطبيقها بنجاح على hSATMVECs من أجل التحقق من صحة النمط الظاهري وإثبات استخدامها في فحوصات الخلايا البطانية الروتينية. أخيرا ، نصف تطبيقا ل hSATMVECs في نموذج تجريبي للحديث المتقاطع بين hSATMVECs-adipocyte.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الدراسة تقنية عزل hSATMVEC المأخوذة من SAT أثناء الزرع الروتيني ل CIEDs. لقد أثبتنا أن hSATMVEC المعزول يتمتع بنقاوة عالية ، ويعبر عن بروتينات الغشاء الخاصة ب EC CD144 و CD31 ، ولا يظهر أي تعبير مهم عن كريات الدم البيضاء CD45. نستمر في إظهار أنه ، بطريقة قابلة للتكرار وموثوقة ، تتكاثر hSATMVEC المعزولة ويمكن استخدامها تجريبيا لدراسة الآلية داخل الخلايا المشاركة في إشارات الأنسولين وتكوين الأوعية. بالإضافة إلى القدرة على استزراعهم بمعزل عن غيرهم، يمكن استخدامها أيضا في الثقافة المشتركة لدراسة الحديث المتقاطع بين الخلايا الدهنية hSATMVEC.
عادة ما يتم الحصول على الخلايا البطانية المستخدمة في الأبحاث الأساسية والانتقالية من الأوعية الكبيرة ، مثل الشريان الأورطي والوريد السري البشري ، أو الأوعية الدموية الدقيقة. هذه المصادر لها حدودهاالخاصة 7,8 ؛ يصعب الوصول إلى الخلايا البطانية من الأوعية الكبيرة (في حالة الأنسجة الأبهرية) أو مشتقة من الأنسجة الوليدية مع احتمال اختلاف الفسيولوجيا والتعرض البيئي9. يسمح استخدام الخلايا البطانية المعزولة من الأنسجة المأخوذة أثناء زرع CIED بالتحقيق والتجريب في علم وظائف الأعضاء الخلوي ضمن مجموعات محددة من المرضى في العالم الحقيقي. يتم زرع CIEDs لمجموعة متنوعة من المؤشرات ، بما في ذلك في المرضى الذين يعانون من بطء نظم القلب وفشل القلب والوقاية الأولية والثانوية من عدم انتظام ضربات القلب البطيني10. غالبا ما يعاني هؤلاء المرضى من أمراض مشتركة متعددة ، بما في ذلك مرض السكري والسمنة وأمراض الشريان التاجي ، والتي تعد محورا عالميا رئيسيا لأبحاث القلب والأوعية الدموية11،12،13. علاوة على ذلك ، في حين أن البيانات التوضيحية في هذه الورقة تتعلق بمراقبة المرضى ، فقد طبقنا هذه التقنيات لعزل ودراسة SATMVEC من مجموعة من المرضى ، بما في ذلك أولئك الذين يعانون من قصور القلب المتقدم و / أو داء السكري من النوع 2.
ليس من النادر أن نواجه مشاكل مع ضعف غلة hSATMVEC بعد محاولة عزل الخلايا. يمكن تقليل هذا الخطر بشكل كبير باستخدام حجم بدء أكبر من SAT لعزل hSATMVEC. بالإضافة إلى ذلك ، نواجه هذا بشكل متكرر في SAT من الأشخاص المصابين بأمراض القلب والأوعية الدموية ، وعلى وجه الخصوص مرض السكري.
أحد قيود هذه التقنية هو أن hSATMVEC المعزول لا يمكن أن يخضع إلا لعدد محدود من الممرات. في تجربتنا بعد المرور 5 ، بغض النظر عن النمط الظاهري للمريض ، يتباطأ انتشار hSATMVEC بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، لا تتكاثر hSATMVEC المعزولة باستخدام هذه التقنية بشكل جيد عندما تكون قليلة السكان. لذلك ، نوصي بعدم تمرير hSATMVEC بنسبة أكبر من 1: 6. كما هو مذكور في الصفحة 1. لقد نجحنا في إذابة وإعادة تنشيط hSATMVEC المخزن في النيتروجين السائل لمدة تصل إلى 4 سنوات ، وفي تجربتنا ، تكون فرصة الإنعاش أكبر عند حفظها بالتبريد عند رقم مرور أقل (عادة ما نقوم بحفظ hSATMVEC بالتبريد في الممر 2).
الأنسجة المأخوذة عند إدخال CIED متاحة مجانا ويمكن حصادها دون الإضرار بالمريض. لذلك ، فإن المصدر السهل الوصول إليه وغير الجراحي نسبيا للخلايا البطانية من مجموعات المرضى هذه له فائدة كبيرة في إجراء البحوث المستهدفة. في حين أن الصور التمثيلية في هذه الورقة مستمدة من مرضى “التحكم” (أي المرضى الذين ليس لديهم تشخيص لفشل القلب أو مرض السكري ، وإن كان ذلك مع إشارة إلى زرع CIED) ، فقد نجحنا في عزل وزراعة وزراعة SATMVECs من المرضى الذين يعانون من قصور القلب والسكري ومجموعة من هذه الأمراض. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه التقنيات على أسرة الأوعية الدموية الدقيقة الأخرى ، بما في ذلك العضلات الهيكلية ، ونحن نعمل حاليا على تحسين نموذج للحديث المتبادل بين العضلات الهيكلية MVEC-myocyte.
يمكن عزل hSATMVECs من الأنسجة البشرية المأخوذة في وقت إدخال CIED وهي ذات نقاء كاف لاستخدامها تجريبيا لدراسة الخلل الوظيفي في الأوعية الدموية الدقيقة والحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية البطانية في الأشخاص المصابين بأمراض القلب والأوعية الدموية أو بدونها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون جدا لقسم التصوير الحيوي بكلية العلوم البيولوجية (جامعة ليدز ، المملكة المتحدة) لاستخدام مرفق قياس التدفق الخلوي ، والذي تم دعمه بتمويل منحة من مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC BB / R000352 / 1). تم دعم SS من قبل زمالة التدريب على البحوث السريرية لمؤسسة القلب البريطانية (FS / CRTF / 20/24071). تم دعم CL من قبل منحة الدكتوراه في مؤسسة القلب البريطانية (FS / 19/59/34896). تم دعم LDR من قبل جائزة زمالة Diabetes UK RD Lawrence (16/0005382). تم دعم RMC من قبل زمالة البحوث السريرية المتوسطة لمؤسسة القلب البريطانية (FS / 12/80/29821). MTK هو أستاذ مؤسسة القلب البريطانية لأبحاث القلب والأوعية الدموية والسكري (CH / 13/1/30086) وحاصل على منحة برنامج مؤسسة القلب البريطانية (RG / F / 22 / 110076)
Materials
| 170L CO2 Incubator | GS Biotech | 170G-014 | |
| 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) | Invitrogen | N13195 | |
| 4% PARAFIX buffered histological fixative | VWR Chemicals | PRC/R/38/1 | |
| Akt (tAkt) Rabbit 1:1000 | Cell Signalling Technology | 9272 | |
| BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Orange, 50/pk | Medisave | 393230 | |
| Bovine Serum Albumin solution, 7.5% | Merck | A8412-100ML | |
| CD144 (VE-Cadherin) Antibody, anti-human, PE, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-118-495 | |
| CD31 Antibody, anti-human, PerCP-Vio 700, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-811 | |
| CD31 MicroBead Kit, human, 1 kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| CD45 Antibody, anti-human, FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-769 | |
| Cell Extraction Buffer | Invitrogen | FNN0011 | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5805000060 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | Cell proliferation imaging kit |
| Collagenase/Dispase, 500 mg | Roche/Merck | 11097113001 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Basement Membrane Matrix |
| Corning 100 mm TC-treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3516 | |
| CytoFLEX S – 4 laser flow Cytometer | Beckman | ||
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Merck | D8537-500ML | |
| EASYstrainer Cell sieve for 50 mL tubes, 70 µm mesh, Blue, sterile, 50/pk | Greiner Bio-One | 542070 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes | Merck | EP0030120094 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Merck | E8008-100ML | |
| Falcon 24 Well TC-Treated Cell Polystyrene Permeable Support Companion Plate, with Lid, Sterile, 1/Pack, 50/Case | Appleton Woods | CF537 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 0.4 µm Transparent PET Membrane, Sterile, 1/Pack, 48/Case | Appleton Woods | CF521 | |
| Freezing Medium Cryo-SFM | PromoCell | C-29912 | |
| Gelatin solution, 2% in water | Merck | G1393-100ML | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x), 100mL | Fisher Scientific | 11570486 | |
| Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12563029 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Merck | H6648-500ML | |
| Human Subcutaneous Preadipocyte Cells | Lonza | PT-5020 | |
| Incucyte ZOOM | Essen BioScience | Live-cell analysis system | |
| Insulin solution human | Merck | I9278-5ML | |
| LS Columns, 25/pk | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Tube Rotator |
| MS Columns, 25/pk | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NuPAGE 4–12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | PT-8002 | |
| Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000 | Cell Signalling Technology | 9570 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Rabbit 1:1000 | Cell Signalling Technology | 4060 | |
| Pre-Separation Filters 30 µm, 50/pk | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution | Cell Signalling Technology | 4087 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Scalpel Disposable Sterile Style 10 | VWRI | 501 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstetd | 62.554.502 | |
| Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print | Sarstetd | 62.547.254 | |
| Total eNOS Mouse 1:1000 | BD Biosciences | 610297 | |
| Triton X-100, BioUltra, for molecular biology | Merck | 93443-500ML | |
| β-Actin (C4) Mouse 1:5000 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 |
References
- Bierhansl, L., et al. Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease. Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), a006429 (2012).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int J Biol Sci. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Brown, O. I., Bridge, K., Kearney, M. T. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases in glucose homeostasis and diabetes-related endothelial cell dysfunction. Cells. 10 (9), 2315 (2021).
- Luk, C., Haywood, N. J., Bridge, K. I., Kearney, M. T. Paracrine role of the endothelium in metabolic homeostasis in health and nutrient excess. Front Cardiovasc Med. 26 (9), 882923 (2022).
- . Click-iT EdU Imaging Kits Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf (2024)
- Bouïs, D., et al. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99 (6), 683-690 (1992).
- Chi, J. T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Brignole, M., et al. 213 ESC Guidelines on cardiac pacing and cardiac resynchronization therapy. Eur Heart J. 34 (29), 2281-2329 (2013).
- Greenspon, A. J., et al. Trends in permanent pacemaker implantation in the United States from 1993 to 2009: Increasing complexity of patients and procedures. J Am Coll Cardiol. 60 (16), 1540-1545 (2012).
- Mendis, S. A., Alwan, A. . Prioritized Research Agenda for Prevention and Control of Noncommunicable Diseases. , (2011).
- Brown, O. I., et al. Relationship among diabetes, obesity, and cardiovascular disease phenotypes: A UK biobank cohort study. Diabetes Care. 46 (8), 1531-1540 (2023).
.