Estudando a conversa cruzada de células endoteliais adiposas/adipócitos no tecido adiposo subcutâneo humano

As amostras de tecido humano utilizadas na técnica descrita foram retiradas de pacientes submetidos à inserção de DCEI indicada por diretrizes de acordo com a prática clínica de rotina no Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Leeds, Reino Unido). O protocolo do estudo, juntamente com toda a outra documentação, foi aprovado pelo comitê de ética local (11/YH/0291) antes da inscrição dos participantes. O estudo foi conduzido em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinque. 1. População de pacientes Obtenha tecido adiposo subcutâneo fresco (SAT) durante o implante do CIED do SAT sobrejacente ao músculo peitoral maior. Isole as amostras de SAT em condições estéreis e manuseie as amostras de tecidos após a coleta em uma capela de fluxo laminar sob condições assépticas estritas para evitar a contaminação bacteriana. 2. Isolamento e cultura de células endoteliais NOTA: Um esquema para isolamento de hSATMVEC é mostrado na Figura 1. Para isolamento de hSATMVEC, use um mínimo de 250 mg de tecido adiposo subcutâneo fresco (SAT) obtido durante o implante de DCEI do SAT sobrejacente ao músculo peitoral maior (ver Figura 1).NOTA: O uso de grandes quantidades de SAT fresco aumenta o rendimento de hSATMVEC durante o isolamento e tem a maior chance de isolamento bem-sucedido e cultura de hSATMVEC. Coloque imediatamente o SAT em uma solução de armazenamento de tecido de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) gelada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL antes de transferir para o laboratório.NOTA: Para obter a maior chance de isolamento bem-sucedido, o isolamento hSATMVEC deve ser realizado o mais rápido possível. No entanto, o SAT pode ser armazenado por até 24 horas no gelo antes do isolamento, se necessário. Preparar uma solução de trabalho de colagenase/dispase a 1 mg/ml da seguinte forma.Primeiro, reconstitua 500 mg de pó liofilizado de colagenase / dispase em 5 mL de água estéril para formar uma solução estoque de colagenase / dispase com uma concentração de 100 mg / mL. Para cada isolamento de hSATMVEC, diluir 100 μL de solução estoque de colagenase / dispase em 10 mL de solução salina balanceada de Hanks fria para obter uma solução de trabalho de 1 mg / mL. Em um gabinete de fluxo laminar, use dois bisturis para picar os tecidos em ~ 1 mm3 pedaços em 500 μL de solução de colagenase / dispase a 1 mg / mL na tampa de uma placa de Petri, triturar e transferir para um tubo de centrífuga limpo de 50 mL. Lave a tampa da placa de Petri com 4,5 mL de solução fresca de colagenase / dispase 1 mg / mL e adicione ao tubo de centrifugação de 50 mL. Deixar digerir durante 30 min a 37 °C num rotador de tubos a 20 rpm. Pare o processo de digestão adicionando 10 mL de meio de crescimento EC completo MV. Triturar a mistura digerida e passá-la por uma peneira de células de 70 μm. Lave a peneira com 10 mL de tampão solução salina e albumina de soro bovino tamponada com fosfato a 0,5% (PBS-BSA). Centrifugar a amostra a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente e rejeitar o sobrenadante. Repita esta etapa com mais 5 mL de PBS-BSA a 0,5%. Em seguida, remova as células mortas usando um kit de remoção de células mortas. Para fazer isso, incube o pellet celular em 200 μL de grânulos de remoção de células mortas (vórtice antes do uso) por 15 min à temperatura ambiente (RT) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Conecte uma coluna LS com um filtro de 30 μm ao ímã separador e coloque um tubo de centrífuga de 15 mL embaixo. Lave a coluna magnética uma vez com 1 mL de tampão de ligação de remoção de células mortas antes de adicionar a suspensão de amostra/grânulo e deixe-a passar passivamente sob gravidade. Em seguida, lave a coluna adicionando 0,5 mL de buffer de ligação e deixe-a passar passivamente pela coluna. Repita esta lavagem quatro vezes. Colete o eluído como uma fração de células vivas, gire as células a 300 x g em RT por 10 min e, em seguida, lave e ressuspenda o pellet resultante em 400 μL de PBS-BSA a 0,5%. Adicione 20 μL de esferas magnéticas revestidas com anti-CD31 às células suspensas e incube por 20 min a 4 ° C. Após a incubação, centrifugar a amostra a 300 x g durante 5 min em RT e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 500 μL de PBS-BSA a 0,5%. Anexar uma coluna MS com um filtro de 30 μm ao íman separador e colocar um tubo de centrífuga de 15 ml por baixo. Prepare a coluna com 500 μL de 0,5% de PBS-BSA. Repita esta etapa duas vezes. Adicione a suspensão de microesferas de células e deixe-a passar sob gravidade. Lave a coluna com 500 μL de PBS-BSA 0,5% três vezes. O fluxo contínuo no tubo de centrífuga sob a coluna contém a fração CD31- . Para coletar a fração CD31+ (ou seja, a fração contendo hSATMVECs), remova a coluna MS do ímã separador e coloque-a em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione 1 mL de PBS-BSA a 0,5% e, em uma ação suave, aplique o êmbolo da coluna para liberar os hSATMVECs capturados. Centrifugar a amostra a 300 x g durante 5 min à RT e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de crescimento EC completo MV e divida a solução celular de 1 mL entre um ou dois poços (dependendo do tamanho do pellet) de uma placa de 24 poços revestida com gelatina a 2% (Passagem 0).NOTA: Não se preocupe se houver poucas células aderentes nos primeiros dias após o isolamento. Mude de mídia a cada 3 dias. Células de cultura a 37 °C com 5% de CO2. Quando as células isoladas atingirem ~ 80% de confluência (2-4 semanas), passe-as para um único poço de uma placa de seis poços (passagem 1).NOTA: As passagens subsequentes podem recolocar as células de um poço doador confluente para os poços receptores. Os experimentos foram realizados em células de passagem 2-4 gerações após as células terem demonstrado pureza >99% usando citometria de fluxo (ver seção 3). As células mantiveram a morfologia endotelial típica até pelo menos a passagem 5. 3. Citometria de fluxo Antes da citometria de fluxo, verifique visualmente os hSATMVECs para garantir que pareçam confluentes e morfologicamente representativos. Realize a avaliação por citometria de fluxo de hSATMVECs na passagem 2, usando células de um único poço de uma placa de 6 poços. Lave as células duas vezes com PBS adicionando 500 μL de PBS bem e aspirando a cada vez. Em seguida, adicione 300 μL / poço de solução quente de tripsina / EDTA (0,25%). Incubar a 37 °C com 5% de CO2 por 2 min. Uma vez destacado, neutralize a solução de tripsina / EDTA com 700 μL de meio de crescimento EC completo MV e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a suspensão celular a 400 x g durante 8 min a RT. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em tampão MACS de 1 mL e divida entre dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL rotulados como controle não corado e amostra corada (500 μL por poço). Adicione mais 500 μL de tampão MACS a cada tubo de microcentrífuga, antes de centrifugar novamente a 400 x g por 8 min em RT. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 100 μL de tampão MACS para controle não corado e coquetel de coloração de 100 μL (Tabela Suplementar 1) para a amostra corada. Comine as células com CD45-FITC (o marcador pan-leucocitário), bem como CD144-PE e CD31-PerCP (que são expressos pelas células endoteliais). Vortex brevemente as células suspensas por 5 s, depois incube a 4 ° C por 10 min. Em seguida, adicione 1 mL de tampão MACS a cada tubo, centrifugue novamente a 400 x g por 8 min em RT e descarte o sobrenadante. Finalmente, ressuspenda o pellet celular em 500 μL de tampão MACS e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Coloque o tubo rotulado em uma caixa de gelo coberta pronta para análise.NOTA: Todas as análises de citometria de fluxo incluídas foram realizadas em um sistema de citômetro de fluxo Beckman Coulter Cytoflex de 4 lasers (usando apenas o laser de excitação de 488 nm). Configure o comprimento de onda máximo de emissão e o filtro para cada fluorocoma da seguinte forma: CD45-FITC – emissão máxima 520 nm, filtro 525/50; CD144-PE – emissão máxima 578 nm, filtro 585/40; CD31-PerCP – emissão máxima 675 nm, filtro 655-730. Conforme ilustrado na Figura 2, registre dados para 10.000 células por amostra em uma porta singlete (P2). Verifique se P1 envolve um aglomerado de células principal e se a maioria dessas células cai na porta singlete P2. Certifique-se de que o controle não corado tenha células CD45-CD144 + CD31 + mínimas como % de singletos. Registar a percentagem de células CD45-CD144+CD31+ na amostra corada. 4. Tempo de duplicação das células endoteliais e proliferação celular (Figura 3) Nas passagens 2 e 3, conte o número de hSATMVECs viáveis para cada amostra usando hemocitometria. Registre a data e a hora de cada contagem de células. Calcule o número de duplicações da população entre esses pontos de acordo com a equação: tempo de duplicação = (duração x log(2))/(log (concentração final)-log(concentração inicial)).NOTA: Uma calculadora online está disponível em https://doubling-time.com/compute.php. Avalie a proliferação de hSATMVECs usando um kit de imagem de proliferação celular disponível comercialmente. Semeie hSATMVECs a uma densidade de 20.000 células por poço em uma placa de 24 poços e deixe-os durante a noite em meio de crescimento EC completo MV para se recuperar. No dia seguinte, adicionar 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) a cada poço diluído em meio de crescimento EC completo MV a uma concentração final de 10 μM. Incubar a 37 °C (5% CO2) durante 2 h. Remova a mídia contendo EdU e lave cada poço duas vezes com PBS. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 15 min em RT. Lave cada poço duas vezes com PBS e adicione 500 μL de Triton X-100 a 0,5% em tampão salino tampão tris-tamponado com solução salina (TBS). Deixe incubar em RT por 20 min.NOTA: Isso permeabiliza a membrana celular, permitindo a entrada de azida marcada com Alexa fluor 488 na célula. Prepare o coquetel de azida rotulado com Alexa fluor 488 de acordo com as instruções do fabricante, dependendo do número de poços (consulte6). Lave cada poço duas vezes com PBS antes de adicionar 100 μL de coquetel de azida marcado com Alexa fluor 488 e incube por 30 min em RT protegido da luz.NOTA: O coquetel de azida rotulado com Alexa fluor 488 reage com o EdU em uma reação de clique. Remova o coquetel de azida rotulado com Alexa fluor 488 e lave duas vezes com PBS. Adicionar 500 μL de iodeto de propídio por alvéolo e incubar durante 20 min a RT.NOTA: Esta etapa contrapõe os núcleos (proliferantes e não proliferantes) de vermelho.Remova o iodeto de propídio, lave duas vezes com PBS e deixe cada poço em 500 μL de PBS para imagem. Imagem de cada poço em 4 campos de alta potência com ampliação de 10x, com excitação/emissão de 495/519 nm para a azida de 488 nm (ver Figura 3C).NOTA: As imagens nas figuras foram capturadas usando um sistema de análise de células vivas com ampliação de 10x com tempo de exposição de 800 ms. Conte o número de células em proliferação (verde) e expresse como uma porcentagem (%) do total de células dentro de cada campo de alta potência (média de 4 regiões por poço). 5. Formação do tubo celular endotelial Deixe Matrigel (matriz da membrana basal; BMM) para descongelar durante a noite no gelo. No dia seguinte, com a placa no gelo, adicione 160 μL de BMM a cada poço de uma placa de 24 poços, conforme necessário. Incline a placa para obter cobertura total de cada poço com BMM. Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 para endurecer enquanto prepara as células. Semeie hSATMVECs a 100.000 células (em 1 mL de meio) por poço. Pipete ao lado do poço e tome cuidado para pipetar lentamente para evitar que a matriz se desprenda. Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO2 durante 4 h.NOTA: Neste ponto, a placa está pronta para ser fotografada. Os resultados e figuras abaixo da imagem de fase no sistema de análise de células vivas com ampliação de 10x foram usados em 5 áreas de poços diferentes (ver Figura 3D). Conte o número de tubos inteiros em cada campo de alta potência e calcule um valor médio para cada amostra. 6. Estimulação insulínica de hSATMVEC Cultive hSATMVEC em uma placa de 6 poços a 37 ° C com 5% de CO2. Uma vez confluente, remova o meio de crescimento de células endoteliais completo MV e lave duas vezes com PBS. Adicione 500 μL de meio de fome sérica (meio de crescimento de células endoteliais MV sem suplementos) a cada poço e deixe incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 4 h. Durante este tempo, prepare alíquotas de 500 μL de concentrações crescentes de insulina (0-150 μM) preparadas em meios de fome de soro. Depois de ficar sem soro por 4 h, remova o meio dos poços, adicione 1 mL de meio contendo insulina (com concentrações crescentes) a cada poço e incube por 10 min a 37 ° C com 5% de CO2. Lave duas vezes com PBS frio antes de adicionar 100 μL de tampão de lise de proteína contendo inibidores de protease e fosfatase para lisar as células para proteína. Quantifique a proteína usando o ensaio BCA.NOTA: No experimento descrito abaixo, os lisados celulares foram incubados por 30 min em banho de gelo e centrifugados a 20.000 x g por 15 min. Antes da eletroforese, as amostras de proteínas foram fervidas para desnaturar as proteínas a 95 °C por 5 min. As proteínas foram resolvidas em um NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A análise de immunoblot foi realizada de acordo com protocolos padrão usando anticorpos fosfoproteicos relevantes e anticorpos proteicos totais (de acordo com as instruções do fabricante). Um anticorpo secundário Ig/HRP apropriado foi usado para detectar o anticorpo primário (de acordo com as instruções do fabricante). Os níveis de proteína foram quantificados por meio de densitometria com base na intensidade das bandas de cada amostra. A ß-actina foi usada como controle de carga quando apropriado. 7. Configuração de co-cultura de hSATMVEC-adipócitos (Figura 4) NOTA: Nos resultados abaixo, pré-adipócitos subcutâneos brancos humanos disponíveis comercialmente na passagem 2 de um único doador caucasiano masculino foram usados em todos os ensaios de adipócitos. Os pré-adipócitos foram inicialmente expandidos do frasco fornecido pelo fornecedor (passagem 0) para doze criogeniais contendo meio de congelamento crio-SFM (passagem 1). Cada placa de co-cultura de 24 poços requer um criovial de pré-adipócitos (passagem 1). Descongele rapidamente cada frasco e placa em um frasco T75 contendo 12-15 mL de meio PGM-2 quente (contendo 10% de FBS, 30 μg / mL de L-glutamina e 15 ng / mL de GA-1000 SingleQuots). Troque de mídia a cada 3 dias até 90% confluente. Uma vez 90% confluente, lave os pré-adipócitos subcutâneos brancos humanos com PBS e adicione 1 mL de solução de tripsina / EDTA (0,25%). Deixe em RT por 2 min e confirme o descolamento com microscopia óptica. Adicione 23 mL de meio PGM-2 para neutralizar a tripsina / EDTA e faça uma solução suspensa de 24 mL de pré-adipócitos. Coloque 1 mL de solução subcutânea de pré-adipócitos brancos humanos suspensa em cada poço de uma placa companheira de co-cultura de 24 poços e cresça até a confluência (geralmente 2-3 dias). Enquanto cresce até a confluência, prepare meios de diferenciação de pré-adipócitos (PDM). Para preparar o PDM, faça um estoque 2x PDM adicionando uma mistura proprietária de insulina, dexametasona, indometacina e isobutil-metilxantina ao meio de base PGM. Dilua 2x PDM em uma proporção de 1:1 com PGM para fazer 1x PDM. Uma vez confluente, diferencie os pré-adipócitos brancos subcutâneos humanos alterando o meio para 1 mL de 1x meio PDM em cada poço (Dia 0). Deixe os pré-adipócitos brancos subcutâneos humanos incubarem a 37 °C 5% CO2 por 10 dias (sem alterações de meio) para se diferenciarem totalmente. Monitore a diferenciação usando microscopia de fase de luz (consulte a Figura 4B).NOTA: Os adipócitos diferenciados não podem ser passados e podem ser usados para ensaios do dia 10 ao dia 12. A diferenciação de adipócitos pode ser medida pela amplificação de mRNA de leptina, adiponectina e PPAR-γ. No dia 6 de diferenciação, semeie hSATMVECs a uma densidade de 5 x 104 células por inserção em 500 μL de meio de crescimento EC completo MV em insertos transwell (membrana de 0,4 μM). Coloque as inserções transwell em um poço com 500 μL de meio de crescimento EC completo MV () e cresça até a confluência a 37 ° C em 5% de CO2. No dia 10, quando os adipócitos estiverem totalmente diferenciados, remova metade do meio PDM de cada poço e transfira as inserções transwell contendo hSATMVEC confluente em seu próprio meio (ECGM-MV) para cada poço (ver Figura 4A). Deixe as células em co-cultura por 24 horas antes de remover as inserções transwell e realize ensaios avaliando a função dos adipócitos.NOTA: Neste momento, os adipócitos também podem ser lisados para isolamento de proteínas ou RNA, se necessário. 8. Captação de adipócito 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2-desoxiglicose (2-NBD)-glicose Após 24 h em co-cultura, remova as inserções celulares contendo hSATMVEC. Em seguida, adicione 2-NBD-glicose ao meio em cada poço para atingir uma concentração final de 20 μM. Proteger da luz e incubar por 30 min a 37 ° C com 5% de CO2. Lave as células duas vezes em PBS e fixe os adipócitos usando 500 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) por 15 min em RT. Lave as células três vezes em PBS antes de deixar em 100 μL de PBS.NOTA: Neste ponto, os adipócitos estão prontos para serem fotografados. Nas figuras incluídas, a imagem de fase e a luz verde (excitação 440-480 nm / emissão 504-544 nm) foram obtidas no sistema de análise de células vivas com ampliação de 10x em quatro campos de alta potência (ver Figura 4C). Quantifique o nível de captação de glicose quantificando a porcentagem verde da área total usando o limite no ImageJ (ou qualquer outro pacote de software semelhante).