Estudio de la diafonía entre células endoteliales adiposas y adipocitos en el tejido adiposo subcutáneo humano

Las muestras de tejido humano utilizadas en la técnica descrita se han tomado de pacientes sometidos a la inserción de CIEDs según la práctica clínica habitual en el Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Leeds, Reino Unido). El protocolo del estudio, junto con el resto de la documentación, fue aprobado por el comité de ética local (11/YH/0291) antes de la inscripción de los participantes. El estudio se llevó a cabo de conformidad con los principios de la Declaración de Helsinki. 1. Población de pacientes Obtener tejido adiposo subcutáneo (SAT) fresco durante la implantación de CIED a partir de SAT que recubre el músculo pectoral mayor. Aísle las muestras de SAT en condiciones estériles y manipule las muestras de tejidos después de la recolección en una campana de flujo laminar bajo estrictas condiciones asépticas para evitar la contaminación bacteriana. 2. Aislamiento y cultivo de células endoteliales NOTA: En la Figura 1 se muestra un esquema para el aislamiento hSATMVEC. Para el aislamiento de hSATMVEC, utilice un mínimo de 250 mg de tejido adiposo subcutáneo (SAT) fresco obtenido durante la implantación de CIED a partir de SAT que recubre el músculo pectoral mayor (ver Figura 1).NOTA: El uso de grandes cantidades de SAT fresco aumenta el rendimiento de hSATMVEC durante el aislamiento y tiene la mayor probabilidad de éxito en el aislamiento y el cultivo de hSATMVEC. Coloque inmediatamente el SAT en una solución de almacenamiento de tejidos de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) helada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml antes de transferirlo al laboratorio.NOTA: Para tener la mayor probabilidad de éxito en el aislamiento, el aislamiento de hSATMVEC debe realizarse lo antes posible. Sin embargo, el SAT puede almacenarse hasta 24 horas en hielo antes del aislamiento si es necesario. Prepare una solución de trabajo de colagenasa/dispasa de 1 mg/mL de la siguiente manera.En primer lugar, reconstituya 500 mg de polvo liofilizado de colagenasa/dispasa en 5 mL de agua estéril para formar una solución madre de colagenasa/dispasa con una concentración de 100 mg/mL. Para cada aislamiento de hSATMVEC, diluya 100 μL de solución madre de colagenasa/dispasa en 10 mL de solución fría de sal equilibrada de Hanks para obtener una solución de trabajo de 1 mg/mL. En una cabina de flujo laminar, use dos bisturíes para picar los tejidos en ~ 1 mm3 piezas en 500 μL de solución de colagenasa/dispasa de 1 mg/mL en la tapa de una placa de Petri, triture y transfiera a un tubo de centrífuga limpio de 50 mL. Lave la tapa de la placa de Petri con 4,5 ml de solución fresca de colagenasa/dispasa de 1 mg/ml y añádala al tubo de centrífuga de 50 ml. Dejar digerir durante 30 min a 37 °C en un rotador de tubos a 20 rpm. Detenga el proceso de digestión agregando 10 mL de medio de crecimiento EC completo MV. Triturar la mezcla digerida y pasarla por un tamiz de celdas de 70 μm. Enjuague el tamiz con 10 mL de tampón de solución salina y albúmina sérica bovina (PBS-BSA) tamponado con fosfato al 0,5%. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Repita este paso con otros 5 mL de PBS-BSA al 0,5%. Luego, elimine las células muertas con un kit de eliminación de células muertas. Para ello, incube el pellet de células en 200 μL de perlas de eliminación de células muertas (vórtice antes de su uso) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Conecte una columna LS con un filtro de 30 μm al imán separador y coloque un tubo de centrífuga de 15 mL debajo. Lave la columna magnética una vez con 1 mL de tampón de unión para la eliminación de células muertas antes de agregar la suspensión de muestra/perla y deje que pase pasivamente bajo la gravedad. A continuación, lave la columna añadiendo 0,5 ml de tampón de unión y deje que pase pasivamente a través de la columna. Repita este lavado cuatro veces. Recoja el eluido como una fracción de célula viva, centrifugue las células a 300 x g a RT durante 10 minutos y, a continuación, lave y vuelva a suspender el pellet resultante en 400 μL de PBS-BSA al 0,5%. Añadir 20 μL de perlas magnéticas recubiertas de anti-CD31 a las células suspendidas e incubar durante 20 min a 4 °C. Después de la incubación, centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min en RT y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de celda en 500 μL de PBS-BSA al 0,5%. Conecte una columna MS con un filtro de 30 μm al imán separador y coloque un tubo de centrífuga de 15 ml debajo. Imprime la columna con 500 μL de PBS-BSA al 0,5%. Repita este paso dos veces. Agregue la suspensión de células y microperlas y deje que pase bajo la gravedad. Lave la columna con 500 μL de PBS-BSA al 0,5% tres veces. El flujo a través del tubo de centrífuga debajo de la columna contiene la fracción CD31-. Para recoger la fracción CD31+ (es decir, la fracción que contiene hSATMVECs), retire la columna MS del imán separador y colóquela en un tubo de centrífuga nuevo de 15 mL. Agregue 1 mL de PBS-BSA al 0,5% y, con una acción suave, aplique el émbolo de columna para liberar los hSATMVEC capturados. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de celda en 1 mL de medio de crecimiento EC completo MV y divida la solución de 1 mL de celda entre uno o dos pocillos (dependiendo del tamaño del pellet) de una placa de 24 pocillos recubierta de gelatina al 2% (Paso 0).NOTA: No se preocupe si hay pocas células adherentes en los primeros días después del aislamiento. Cambie los medios cada 3 días. Cultivo de células a 37 °C con 5% de CO2. Una vez que las células aisladas alcanzan ~80% de confluencia (2-4 semanas), páselas a un solo pocillo de una placa de seis pocillos (pasaje 1).NOTA: Los pasajes subsiguientes pueden re-platear las células de un pocillo donante confluente a los pocillos receptores. Los experimentos se realizaron en células de la generación de paso 2-4 después de que las células hubieran demostrado una pureza del >99% mediante citometría de flujo (ver sección 3). Las células mantuvieron la morfología endotelial típica hasta al menos el pasaje 5. 3. Citometría de flujo Antes de la citometría de flujo, se deben revisar visualmente los hSATMVEC para asegurarse de que parecían confluentes y morfológicamente representativos. Realice una evaluación citométrica de flujo de hSATMVEC en el paso 2, utilizando celdas de un solo pocillo de una placa de 6 pocillos. Lave las células dos veces con PBS añadiendo bien 500 μL de PBS y aspirando cada vez. A continuación, añadir 300 μL/pocillo de solución tibia de tripsina/EDTA (0,25%). Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 min. Una vez desmontado, neutralizar la solución de tripsina/EDTA con 700 μL de medio de crecimiento EC completo MV y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar la suspensión de la célula a 400 x g durante 8 min en RT. Deseche el sobrenadante sin alterar el pellet. A continuación, vuelva a suspender el pellet de celda en un tampón MACS de 1 mL y divídalo entre dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetados como control sin tinción y muestra teñida (500 μL por pocillo). Añada 500 μL adicionales de tampón MACS a cada tubo de microcentrífuga, antes de volver a centrifugar a 400 x g durante 8 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 100 μL de tampón MACS para el control sin tinción y 100 μL de cóctel de tinción (Tabla suplementaria 1) para la muestra teñida. Teñir las células con CD45-FITC (el marcador panleucocitario), así como con CD144-PE y CD31-PerCP (que son expresados por las células endoteliales). Agitar brevemente las células suspendidas durante 5 s, luego incubar a 4 °C durante 10 min. A continuación, añada 1 mL de tampón MACS a cada tubo, centrifugue de nuevo a 400 x g durante 8 min en RT y deseche el sobrenadante. Por último, vuelva a suspender el pellet de la célula en 500 μL de tampón MACS y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Coloque el tubo etiquetado en una caja de hielo cubierta lista para su análisis.NOTA: Todos los análisis de citometría de flujo incluidos se realizaron en un sistema de citómetro de flujo Beckman Coulter Cytoflex de 4 láseres (utilizando solo el láser de excitación de 488 nm). Configure la longitud de onda de emisión máxima y el filtro para cada fluoroccoma de la siguiente manera: CD45-FITC – emisión máxima 520 nm, filtro 525/50; CD144-PE – emisión máxima 578 nm, filtro 585/40; CD31-PerCP – emisión máxima 675 nm, filtro 655-730. Como se ilustra en la Figura 2, registre los datos de 10.000 células por muestra en una puerta singlete (P2). Compruebe que P1 rodea un grupo de células principal y que la mayoría de estas células se encuentran en la puerta singlete de P2. Asegúrese de que el control sin tinción tenga un mínimo de células CD45-CD144+CD31+ como porcentaje de singletes. Registre el porcentaje de singletes de células CD45-CD144+CD31+ en la muestra teñida. 4. Tiempo de duplicación de células endoteliales y proliferación celular (Figura 3) En los pasajes 2 y 3, cuente el número de hSATMVEC viables para cada muestra utilizando hemocitometría. Registre la fecha y la hora de cada recuento de células. Calcule el número de duplicaciones de población entre estos puntos de acuerdo con la ecuación: tiempo de duplicación = (duración x log(2))/(log (concentración final)-log (concentración inicial)).NOTA: Una calculadora en línea está disponible en https://doubling-time.com/compute.php. Evaluar la proliferación de hSATMVECs utilizando un kit de imágenes de proliferación celular disponible en el mercado. Siembre hSATMVECs a una densidad de 20.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos y déjelas toda la noche en medios de crecimiento de EC completos MV para que se recuperen. Al día siguiente, añadir 5-Ethinil-2′-desoxiuridina (EdU) a cada pocillo diluido en un medio de crecimiento EC completo MV a una concentración final de 10 μM. Incubar a 37 °C (5% CO2) durante 2 h. Retire los medios que contienen EdU y lave cada pocillo dos veces con PBS. Fije las celdas con paraformaldehído al 4% durante 15 min en RT. Lave cada pocillo dos veces con PBS y agregue 500 μL de Triton X-100 al 0,5% en tampón de solución salina (TBS) tamponado por tris. Dejar incubar a RT durante 20 min.NOTA: Esto permeabiliza la membrana celular, permitiendo la entrada de azida marcada con Alexa fluor 488 en la célula. Prepare el cóctel de azida con Alexa fluor 488 marcado según las instrucciones del fabricante, dependiendo del número de pocillos (ver6). Lave cada pocillo dos veces con PBS antes de agregar 100 μL de cóctel de azida marcado con Alexa fluor 488 e incube durante 30 minutos a RT protegido de la luz.NOTA: El cóctel de azida con etiqueta Alexa fluor 488 reacciona con el EdU en una reacción de clic. Retire el cóctel de azida con etiqueta Alexa fluor 488 y lávelo dos veces con PBS. Añadir 500 μL de yoduro de propidio por pocillo e incubar durante 20 min a RT.NOTA: Este paso contratiñe los núcleos (tanto proliferantes como no proliferantes) de rojo.Retire el yoduro de propidio, lávese dos veces con PBS y deje cada pocillo en 500 μL de PBS para la obtención de imágenes. Visualice cada pozo en 4 campos de alta potencia con un aumento de 10x, con excitación/emisión de 495/519 nm para la azida de 488 nm (ver Figura 3C).NOTA: Las imágenes de las figuras se capturaron utilizando un sistema de análisis de células vivas con un aumento de 10x con un tiempo de exposición de 800 ms. Cuente el número de células en proliferación (verde) y exprese como porcentaje (%) del total de células dentro de cada campo de alta potencia (promedio de 4 regiones por pocillo). 5. Formación del tubo de células endoteliales Leave Matrigel (matriz de membrana basal; BMM) para descongelar durante la noche sobre hielo. Al día siguiente, con la placa en hielo, agregue 160 μL de BMM a cada pocillo de una placa de 24 pocillos según sea necesario. Incline la placa para obtener una cobertura completa de cada pocillo con BMM. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 para que se asiente mientras prepara las celdas. Siembre hSATMVECs a 100.000 células (en 1 mL de medio) por pocillo. Pipetear en el lado del pocillo y tener cuidado de pipetear lentamente para evitar que la matriz se desprenda. Incubar la placa a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 h.NOTA: En este punto, la placa está lista para ser fotografiada. Los resultados y las figuras a continuación de las imágenes de fase en el sistema de análisis de células vivas con un aumento de 10x se utilizaron en 5 áreas de pozos diferentes (ver Figura 3D). Cuente el número de tubos enteros en cada campo de alta potencia y calcule un valor promedio para cada muestra. 6. Estimulación insulínica de hSATMVEC Cultivo hSATMVEC en una placa de 6 pocillos a 37 °C con 5% de CO2. Una vez confluente, retire el medio de crecimiento de células endoteliales completo MV y lávese dos veces con PBS. Añadir 500 μL de medios de inanición sérica (medios de crecimiento de células endoteliales MV sin suplementos) a cada pocillo y dejar incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 h. Durante este tiempo, prepare 500 μL de alícuotas de concentraciones crecientes de insulina (0-150 μM) preparadas en medios de inanición sérica. Después de pasar hambre de suero durante 4 h, retire los medios de los pocillos, agregue 1 ml de medios que contengan insulina (con concentraciones crecientes) a cada pocillo e incube durante 10 minutos a 37 °C con 5% de CO2. Lavar dos veces con PBS frío antes de añadir 100 μL de tampón de lisis de proteínas que contiene inhibidores de la proteasa y la fosfatasa para lisar las células en busca de proteínas. Cuantifique la proteína mediante el ensayo BCA.NOTA: En el experimento que se describe a continuación, se incubaron lisados celulares durante 30 minutos en un baño de hielo y se centrifugaron a 20.000 x g durante 15 minutos. Antes de la electroforesis, las muestras de proteínas se hirvieron para desnaturalizar las proteínas a 95 °C durante 5 min. Las proteínas se resolvieron en un gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. El análisis de inmunotransferencia se realizó de acuerdo con los protocolos estándar utilizando anticuerpos fosfoproteicos relevantes y anticuerpos proteicos totales (según las instrucciones del fabricante). Se utilizó un anticuerpo secundario Ig/HRP adecuado para detectar el anticuerpo primario (de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Los niveles de proteína se cuantificaron mediante densitometría basada en la intensidad de las bandas de cada muestra. ß-actina se utilizó como control de carga cuando fue apropiado. 7. Configuración del cocultivo de adipocitos hSATMVEC (Figura 4) NOTA: En los resultados a continuación, se utilizaron preadipocitos subcutáneos blancos humanos disponibles comercialmente en el pasaje 2 de un solo donante caucásico masculino en todos los ensayos de adipocitos. Inicialmente, los preadipocitos se expandieron desde el vial suministrado por el proveedor (pasaje 0) a doce crioviales que contenían medios de congelación crio-SFM (pasaje 1). Cada placa de cocultivo de 24 pocillos requiere un criovial de preadipocitos (pasaje 1). Descongele rápidamente cada vial y placa en un matraz T75 que contenga 12-15 mL de medio PGM-2 tibio (que contenga 10% de FBS, 30 μg/mL de L-glutamina y 15 ng/mL de GA-1000 SingleQuots). Cambiar de medio cada 3 días hasta que el 90% confluya. Una vez confluente al 90%, lavar los preadipocitos subcutáneos blancos humanos con PBS y luego añadir 1 mL de solución de tripsina/EDTA (0,25%). Dejar actuar en RT durante 2 min y confirmar el desprendimiento con microscopía óptica. Agregue 23 mL de medio PGM-2 para neutralizar la tripsina/EDTA y haga una solución suspendida de preadipocitos de 24 mL. Coloque 1 mL de solución de preadipocitos blancos subcutáneos humanos en suspensión en cada pocillo de una placa complementaria de cocultivo de 24 pocillos y crezca hasta la confluencia (generalmente 2-3 días). Mientras crece hasta la confluencia, prepare los medios de diferenciación de preadipocitos (PDM). Para preparar PDM, haga un stock de PDM 2x agregando una mezcla patentada de insulina, dexametasona, indometacina e isobutil-metilxantina a los medios base de PGM. Diluya 2x PDM en una proporción de 1:1 con PGM para hacer 1x PDM. Una vez confluentes, diferencie los preadipocitos blancos subcutáneos humanos cambiando el medio a 1 mL de 1x medio PDM en cada pocillo (Día 0). Deje incubar los preadipocitos blancos subcutáneos humanos a 37 °C con 5% de CO2 durante 10 días (sin cambios de medio) para que se diferencien completamente. Monitorice la diferenciación mediante microscopía de fase luminosa (véase la figura 4B).NOTA: Los adipocitos diferenciados no se pueden pasar y se pueden usar para ensayos desde el día 10 hasta el día 12. La diferenciación de los adipocitos puede medirse mediante la amplificación del ARNm de leptina, adiponectina y PPAR-γ. En el día 6 de diferenciación, se siembran hSATMVECs a una densidad de 5 x 104 células por inserto en 500 μL de medios de crecimiento EC completos MV en insertos transpocillos (membrana de 0,4 μM). Coloque los insertos transwell en un pocillo con 500 μL de medio de crecimiento EC completo MV () y crezca hasta la confluencia a 37 °C en 5% de CO2. En el día 10, cuando los adipocitos estén completamente diferenciados, extraiga la mitad del medio PDM de cada pocillo y transfiera los insertos transpocillos que contienen hSATMVEC confluente en su propio medio (ECGM-MV) a cada pocillo (ver Figura 4A). Dejar las células en cocultivo durante 24 horas antes de retirar los insertos transpocillos y realizar ensayos que evalúen la función de los adipocitos.NOTA: En este momento, los adipocitos también se pueden lisar para el aislamiento de proteínas o ARN si es necesario. 8. Absorción de glucosa por adipocitos 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2-desoxiglucosa (2-NBD)-glucosa Después de 24 h en cocultivo, retire los insertos celulares que contengan hSATMVEC. A continuación, añada 2-NBD-glucosa al medio en cada pocillo para lograr una concentración final de 20 μM. Proteger de la luz e incubar durante 30 min a 37 °C con 5% de CO2. Lavar las células dos veces en PBS y fijar los adipocitos con 500 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min en RT. Lavar las células tres veces en PBS antes de dejar en 100 μL de PBS.NOTA: En este punto, los adipocitos están listos para ser fotografiados. En las figuras incluidas, se obtuvieron imágenes de fase y luz verde (excitación 440-480 nm/emisión 504-544 nm) en el sistema de análisis de células vivas con un aumento de 10x en cuatro campos de alta potencia (véase la Figura 4C). Cuantifique el nivel de absorción de glucosa cuantificando el porcentaje de verde del área total utilizando umbrales en ImageJ (o cualquier otro paquete de software similar).