Étude de la diaphonie entre les cellules endothéliales adipeuses adipeuses et les adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané humain

Les échantillons de tissus humains utilisés dans la technique décrite ont été prélevés sur des patients subissant une insertion de CIED indiquée par les lignes directrices, conformément à la pratique clinique de routine, au Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Leeds, Royaume-Uni). Le protocole de l’étude, ainsi que toute la documentation, a été approuvé par le comité d’éthique local (11/YH/0291) avant l’inscription des participants. L’étude a été menée dans le respect des principes de la Déclaration d’Helsinki. 1. Population de patients Obtenez du tissu adipeux sous-cutané (SAT) frais lors de l’implantation CIED à partir du SAT recouvrant le muscle grand pectoral. Isolez les échantillons SAT dans des conditions stériles et manipulez les échantillons de tissus après le prélèvement dans une hotte à flux laminaire dans des conditions aseptiques strictes pour éviter la contamination bactérienne. 2. Isolement et culture de cellules endothéliales REMARQUE : La Figure 1 présente un schéma d’isolement hSATMVEC. Pour l’isolement du hSATMVEC, utilisez un minimum de 250 mg de tissu adipeux sous-cutané (SAT) frais obtenu lors de l’implantation du CIED à partir d’un SAT recouvrant le muscle grand pectoral (voir Figure 1).REMARQUE : L’utilisation de plus grandes quantités de SATMVEC frais augmente le rendement de hSATMVEC pendant l’isolement et présente les meilleures chances de réussite de l’isolement et de la culture de hSATMVEC. Placez immédiatement SAT dans une solution de stockage de tissus de tri cellulaire activé magnétique (MACS) glacée dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avant de le transférer au laboratoire.REMARQUE : Pour avoir les meilleures chances de réussite de l’isolement, l’isolement hSATMVEC doit être effectué dès que possible. Cependant, le SAT peut être stocké jusqu’à 24 heures sur la glace avant d’être isolé si nécessaire. Préparez une solution de travail de collagénase/dispase de 1 mg/mL comme suit.Tout d’abord, reconstituer 500 mg de poudre lyophilisée de collagénase/dispase dans 5 mL d’eau stérile pour former une solution mère de collagénase/dispase à une concentration de 100 mg/mL. Pour chaque isolement hSATMVEC, diluer 100 μL de solution mère de collagénase/dispase dans 10 mL de solution de sel équilibré Hanks’ froid pour obtenir une solution de travail de 1 mg/mL. Dans une armoire à flux laminaire, à l’aide de deux scalpels, hacher les tissus en3 morceaux de ~1 mm dans 500 μL de solution de collagénase/dispase à 1 mg/mL sur le couvercle d’une boîte de Pétri, triturer et transférer dans un tube à centrifuger propre de 50 mL. Lavez le couvercle de la boîte de Pétri avec 4,5 ml de solution fraîche de collagénase/dispase à 1 mg/ml et ajoutez-la dans le tube à centrifuger de 50 ml. Laisser digérer 30 min à 37 °C dans un rotateur tubulaire à 20 tr/min. Arrêtez le processus de digestion en ajoutant 10 ml de substrat de croissance EC complet MV. Triturez le mélange digéré et passez-le dans un tamis à cellules de 70 μm. Rincer le tamis avec 10 ml de tampon d’albumine sérique saline – bovine tamponnée à 0,5 % de phosphate. Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Répétez cette étape avec 5 ml supplémentaires de PBS-BSA à 0,5 %. Ensuite, retirez les cellules mortes à l’aide d’un kit d’élimination des cellules mortes. Pour ce faire, incubez la pastille de cellule dans 200 μL de billes d’élimination des cellules mortes (vortex avant utilisation) pendant 15 min à température ambiante (RT) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Fixez une colonne LS avec un filtre de 30 μm à l’aimant séparateur et placez un tube de centrifugation de 15 ml en dessous. Lavez une fois la colonne magnétique avec 1 mL de tampon de liaison pour l’élimination des cellules mortes avant d’ajouter la suspension d’échantillon/bille et laissez-la passer passivement sous l’effet de la gravité. Ensuite, lavez la colonne en ajoutant 0,5 ml de tampon de liaison et laissez-le passer passivement à travers la colonne. Répétez ce lavage quatre fois. Prélever l’éluat sous forme de fraction de cellules vivantes, faire tourner les cellules à 300 x g à RT pendant 10 min, puis laver et remettre en suspension la pastille obtenue dans 400 μL de PBS-BSA à 0,5 %. Ajouter 20 μL de billes magnétiques enrobées d’anti-CD31 dans les cellules suspendues et incuber pendant 20 min à 4 °C. Après l’incubation, centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de PBS-BSA à 0,5 %. Fixez une colonne MS avec un filtre de 30 μm à l’aimant séparateur et placez un tube de centrifugation de 15 ml en dessous. Amorcez la colonne avec 500 μL de PBS-BSA à 0,5 %. Répétez cette étape deux fois. Ajoutez la suspension cellule-microbille et laissez-la passer sous l’effet de la gravité. Lavez trois fois la colonne avec 500 μL de PBS-BSA à 0,5 %. Le flux dans le tube de centrifugation sous la colonne contient la fraction CD31- . Pour recueillir la fraction CD31+ (c’est-à-dire la fraction contenant des hSATMVEC), retirez la colonne MS de l’aimant du séparateur et placez-la dans un tube à centrifuger neuf de 15 mL. Ajouter 1 mL de PBS-BSA à 0,5 % et, en une seule action douce, appliquer le piston de la colonne pour libérer les hSATMVEC capturés. Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu de croissance EC complet MV et répartir la solution cellulaire de 1 mL entre un ou deux puits (selon la taille de la pastille) d’une plaque à 24 puits recouverte de gélatine à 2 % (passage 0).REMARQUE : Ne vous inquiétez pas s’il y a peu de cellules adhérentes dans les premiers jours suivant l’isolement. Changez de support tous les 3 jours. Cellules de culture à 37 °C avec 5% de CO2. Une fois que les cellules isolées atteignent ~80% de confluence (2-4 semaines), passez-les sur un seul puits d’une plaque à six puits (passage 1).REMARQUE : Les passages subséquents peuvent replacer les cellules d’un puits donneur confluent vers les puits récepteurs. Des expériences ont été réalisées sur des cellules de génération de passage 2 à 4 après que les cellules aient démontré une pureté de >99% par cytométrie en flux (voir rubrique 3). Les cellules ont conservé la morphologie endothéliale typique au moins jusqu’au passage 5. 3. Cytométrie en flux Avant la cytométrie en flux, vérifiez visuellement les hSATMVECs pour vous assurer qu’ils semblaient confluents et morphologiquement représentatifs. Effectuer une évaluation par cytométrie en flux des hSATMVECs au passage 2, en utilisant des cellules provenant d’un seul puits d’une plaque à 6 puits. Lavez les cellules deux fois avec du PBS en ajoutant bien 500 μL de PBS et en aspirant à chaque fois. Ensuite, ajoutez 300 μL/puits de solution chaude de trypsine/EDTA (0,25 %). Incuber à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 2 min. Une fois détaché, neutraliser la solution de trypsine/EDTA avec 700 μL de milieu de croissance EC complet MV et transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 8 min à RT. Jeter le surnageant sans déranger la pastille. Ensuite, mettez la pastille de cellule en suspension dans un tampon MACS de 1 mL et répartissez-la entre deux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL étiquetés témoin non coloré et échantillon coloré (500 μL par puits). Ajouter 500 μL supplémentaires de tampon MACS dans chaque tube de microcentrifugation, avant de centrifuger à nouveau à 400 x g pendant 8 min à RT. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de tampon MACS pour un contrôle non coloré et un cocktail de coloration de 100 μL (tableau supplémentaire 1) pour l’échantillon coloré. Colorer les cellules avec CD45-FITC (le marqueur pan-leucocytaire), ainsi que CD144-PE et CD31-PerCP (qui sont exprimés par les cellules endothéliales). Agiter brièvement les cellules en suspension pendant 5 s, puis incuber à 4 °C pendant 10 min. Ensuite, ajoutez 1 ml de tampon MACS dans chaque tube, centrifugez à nouveau à 400 x g pendant 8 min à RT et jetez le surnageant. Enfin, mettez la pastille de cellule en suspension dans 500 μL de tampon MACS et transférez-la dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL. Placez le tube étiqueté dans une glacière couverte prête à être analysée.REMARQUE : Toutes les analyses de cytométrie en flux incluses ont été effectuées sur un système de cytomètre en flux Beckman Coulter Cytoflex à 4 lasers (en utilisant uniquement le laser d’excitation de 488 nm). Réglez la longueur d’onde d’émission maximale et le filtre pour chaque fluorochome comme suit : CD45-FITC – émission maximale 520 nm, filtre 525/50 ; CD144-PE – émission maximale 578 nm, filtre 585/40 ; CD31-PerCP – émission maximale 675 nm, filtre 655-730. Comme l’illustre la figure 2, enregistrez les données de 10 000 cellules par échantillon dans une porte singulet (P2). Vérifiez que P1 entoure un amas de cellules majeur et que la plupart de ces cellules se trouvent dans la porte singulet P2. S’assurer que le témoin non coloré a un minimum de cellules CD45-CD144+CD31+ en pourcentage de singulets. Enregistrer le pourcentage de singlets de cellules CD45-CD144+CD31+ dans l’échantillon coloré. 4. Temps de doublement des cellules endothéliales et prolifération cellulaire (Figure 3) Aux passages 2 et 3, comptez le nombre de hSATMVEC viables pour chaque échantillon à l’aide de l’hémocytométrie. Notez la date et l’heure de chaque comptage cellulaire. Calculez le nombre de doublements de population entre ces points selon l’équation : temps de doublement = (durée x log(2))/(log (concentration finale)-log(concentration initiale)).REMARQUE : Un calculateur en ligne est disponible à https://doubling-time.com/compute.php. Évaluez la prolifération des hSATMVECs à l’aide d’un kit d’imagerie de la prolifération cellulaire disponible dans le commerce. Semez les hSATMVECs à une densité de 20 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits et laissez-les passer la nuit dans un milieu de croissance EC complet MV pour récupérer. Le lendemain, ajouter la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) dans chaque puits dilué dans un milieu de croissance EC complet MV à une concentration finale de 10 μM. Incuber à 37 °C (5 % CO2) pendant 2 h. Retirez le support contenant de l’EdU et lavez bien chaque puits deux fois avec du PBS. Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes à RT. Lavez chaque puits deux fois avec du PBS et ajoutez 500 μL de Triton X-100 à 0,5 % dans un tampon salin tris-tamponné (TBS). Laisser incuber à RT pendant 20 min.REMARQUE : Cela perméabilise la membrane cellulaire, permettant l’entrée de l’azoture marqué au fluor Alexa 488 dans la cellule. Préparez le cocktail azoté étiqueté Alexa fluor 488 selon les instructions du fabricant, en fonction du nombre de puits (voir6). Lavez chaque puits deux fois avec du PBS avant d’ajouter 100 μL de cocktail azoté marqué Alexa fluor 488 et incubez pendant 30 min à RT à l’abri de la lumière.REMARQUE : Le cocktail azoté étiqueté Alexa fluor 488 réagit avec l’EdU dans une réaction de clic. Retirez le cocktail azoté étiqueté Alexa fluor 488 et lavez-le deux fois avec du PBS. Ajouter 500 μL d’iodure de propidium par puits et incuber pendant 20 min à RT.REMARQUE : Cette étape permet de contre-colorer les noyaux (proliférants et non proliférants) en rouge.Retirez l’iodure de propidium, lavez deux fois avec du PBS et laissez chaque puits dans 500 μL de PBS pour l’imagerie. Imagez chaque puits dans 4 champs de haute puissance à un grossissement de 10x, avec une excitation/émission de 495/519 nm pour l’azoture de 488 nm (voir Figure 3C).REMARQUE : Les images des figures ont été capturées à l’aide d’un système d’analyse de cellules vivantes à un grossissement de 10x avec un temps d’exposition de 800 ms. Compter le nombre de cellules en prolifération (vert) et exprimer en pourcentage (%) du nombre total de cellules dans chaque champ de forte puissance (moyenne de 4 régions par puits). 5. Formation du tube cellulaire endothélial Leave Matrigel (matrice de membrane basale ; BMM) à décongeler pendant la nuit sur de la glace. Le lendemain, avec la plaque sur la glace, ajoutez 160 μL de BMM dans chaque puits d’une plaque de 24 puits au besoin. Inclinez la plaque pour obtenir une couverture complète de chaque puits avec BMM. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 à prendre pendant la préparation des cellules. Ensemencer les hSATMVECs à 100 000 cellules (dans 1 mL de milieu) par puits. Pipette sur le côté du puits et prendre soin de pipeter lentement pour éviter que la matrice ne se détache. Incuber la plaque à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 4 h.REMARQUE : À ce stade, la plaque est prête à être imagée. L’imagerie de phase sur le système d’analyse de cellules vivantes à un grossissement de 10x a été utilisée dans 5 zones de puits différentes (voir Figure 3D). Comptez le nombre de tubes entiers dans chaque champ de haute puissance et calculez une valeur moyenne pour chaque échantillon. 6. Stimulation insulinique du hSATMVEC Culture hSATMVEC dans une plaque à 6 puits à 37 °C avec 5% de CO2. Une fois confluent, retirez le milieu de croissance des cellules endothéliales complet MV et lavez-le deux fois avec du PBS. Ajouter 500 μL de milieu de famine sérique (milieu de croissance des cellules endothéliales MV sans suppléments) dans chaque puits et laisser incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 4 h. Pendant ce temps, préparez des aliquotes de 500 μL de concentrations croissantes d’insuline (0-150 μM) préparées dans un milieu de famine sérique. Après avoir été privé de sérum pendant 4 h, retirez le milieu des puits, ajoutez 1 ml de milieu contenant de l’insuline (avec des concentrations croissantes) dans chaque puits et incubez pendant 10 min à 37 °C avec 5 % de CO2. Laver deux fois avec du PBS à froid avant d’ajouter 100 μL de tampon de lyse des protéines contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase pour lyser les cellules pour les protéines. Quantifier la protéine à l’aide du dosage des BCA.REMARQUE : Dans l’expérience décrite ci-dessous, des lysats cellulaires ont été incubés pendant 30 minutes dans un bain de glace et centrifugés à 20 000 x g pendant 15 minutes. Avant l’électrophorèse, des échantillons de protéines ont été bouillis pour dénaturer les protéines à 95 °C pendant 5 min. Les protéines ont été résolues sur un gel de Bis-Tris NuPAGE 4-12 % et transférées sur une membrane de nitrocellulose. L’analyse par immunotransfert a été effectuée conformément aux protocoles standard à l’aide d’anticorps phosphoprotéiques et d’anticorps protéiques totaux pertinents (selon les instructions du fabricant). Un anticorps secondaire Ig/HRP approprié a été utilisé pour détecter l’anticorps primaire (selon les instructions du fabricant). Les niveaux de protéines ont été quantifiés à l’aide d’une densitométrie basée sur l’intensité des bandes de chaque échantillon. La ß-actine a été utilisée comme contrôle de la charge le cas échéant. 7. Mise en place d’une co-culture hSATMVEC-adipocytes (Figure 4) REMARQUE : Dans les résultats ci-dessous, des préadipocytes sous-cutanés blancs humains disponibles dans le commerce au passage 2 provenant d’un seul donneur mâle caucasien ont été utilisés dans tous les dosages adipocytaires. Les préadipocytes ont d’abord été étendus à partir du flacon fourni par le fournisseur (passage 0) en douze cryoflacons contenant des milieux de congélation cryo-SFM (passage 1). Chaque plaque de co-culture de 24 puits nécessite un cryoflacon de préadipocytes (passage 1). Décongeler rapidement chaque flacon et chaque plaque dans une fiole T75 contenant de 12 à 15 mL de milieu chaud PGM-2 (contenant 10 % de FBS, 30 μg/mL de L-glutamine et 15 ng/mL de GA-1000 SingleQuots). Changer de média tous les 3 jours jusqu’à ce que 90% de confluent. Une fois que 90 % sont confluents, laver les préadipocytes sous-cutanés blancs humains avec du PBS, puis ajouter 1 ml de solution de trypsine/EDTA (0,25 %). Laisser à RT pendant 2 min et confirmer le détachement par microscopie optique. Ajouter 23 mL de milieu PGM-2 pour neutraliser la trypsine/EDTA et faire une solution de 24 mL en suspension de préadipocytes. Mettre 1 mL de solution sous-cutanée de préadipocytes blancs humains en suspension dans chaque puits d’une plaque compagnon de co-culture de 24 puits et faire croître jusqu’à la confluence (généralement 2-3 jours). Pendant la croissance jusqu’à la confluence, préparer des milieux de différenciation des préadipocytes (PDM). Pour préparer le PDM, préparez une crosse 2x PDM en ajoutant un mélange exclusif d’insuline, de dexaméthasone, d’indométacine et d’isobutyl-méthylxanthine à un milieu de base de PGM. Diluez 2x PDM dans un rapport de 1:1 avec des PGM pour obtenir 1x PDM. Une fois confluents, différencier les préadipocytes blancs sous-cutanés humains en changeant le milieu en 1 mL de 1x milieu PDM dans chaque puits (jour 0). Laissez les préadipocytes blancs sous-cutanés humains incuber à 37 °C 5 % de CO2 pendant 10 jours (sans changement de milieu) pour se différencier complètement. Surveiller la différenciation à l’aide de la microscopie en phase optique (voir Figure 4B).REMARQUE : Les adipocytes différenciés ne peuvent pas être évacués et peuvent être utilisés pour des dosages du jour 10 au jour 12. La différenciation adipocytaire peut être mesurée par amplification de leptine, d’adiponectine et de PPAR-γ. Au jour 6 de la différenciation, amorcer des hSATMVECs à une densité de 5 x 104 cellules par insert dans un milieu de croissance EC complet de 500 μL MV sur des inserts de transpuits (membrane de 0,4 μM). Placez les inserts transwell dans un puits contenant 500 μL de milieu de croissance EC complet MV () et faites-les croître jusqu’à la confluence à 37 °C avec 5 % de CO2. Au jour 10, lorsque les adipocytes sont complètement différenciés, retirer la moitié du milieu PDM de chaque puits et transférer les inserts de transpuits contenant le hSATMVEC confluent dans leur propre milieu (ECGM-MV) dans chaque puits (voir Figure 4A). Laissez les cellules en co-culture pendant 24 heures avant de retirer les inserts de transpuits et d’effectuer des tests évaluant la fonction adipocytaire.REMARQUE : À ce stade, les adipocytes peuvent également être lysés pour l’isolement des protéines ou de l’ARN si nécessaire. 8. Absorption du glucose par le 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-désoxyglucose (2-NBD)-glucose adipocytaire Après 24 h de co-culture, retirer les inserts cellulaires contenant hSATMVEC. Ensuite, ajoutez du glucose 2-NBD dans le milieu de chaque puits pour obtenir une concentration finale de 20 μM. Protéger de la lumière et incuber pendant 30 min à 37 °C avec 5% de CO2. Laver les cellules deux fois dans du PBS et fixer les adipocytes à l’aide de 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 15 min à RT. Laver les cellules trois fois dans du PBS avant de laisser dans 100 μL de PBS.REMARQUE : À ce stade, les adipocytes sont prêts à être imagés. Dans les figures incluses, l’imagerie de phase et la lumière verte (excitation 440-480 nm/émission 504-544 nm) ont été obtenues sur le système d’analyse de cellules vivantes à un grossissement de 10x dans quatre champs de forte puissance (voir Figure 4C). Quantifiez le niveau d’absorption de glucose en quantifiant le pourcentage vert de la surface totale à l’aide du seuillage dans ImageJ (ou tout autre logiciel similaire).