חקר שיחות צולבות של תאי אנדותל שומן/אדיפוציטים ברקמת שומן תת-עורית אנושית

דגימות הרקמה האנושית המשמשות בטכניקה המתוארת נלקחו מחולים שעברו החדרה של CIEDs על פי פרקטיקה קלינית שגרתית בבתי החולים לידס NHS Trust (לידס, בריטניה). פרוטוקול המחקר, יחד עם כל המסמכים האחרים, אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (11/YH/0291) לפני רישום המשתתפים. המחקר נערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי. 1. אוכלוסיית החולים השג רקמת שומן תת עורית טרייה (SAT) במהלך השתלת CIED מ- SAT מעל שריר החזה הראשי. בודד דגימות SAT בתנאים סטריליים וטפל בדגימות הרקמות לאחר איסוף במכסה מנוע זרימה למינרית בתנאים אספטיים מחמירים למניעת זיהום חיידקי. 2. בידוד תאי אנדותל ותרבית הערה: סכימה לבידוד hSATMVEC מוצגת באיור 1. לבידוד hSATMVEC, יש להשתמש במינימום של 250 מ”ג של רקמת שומן תת-עורית טרייה (SAT) המתקבלת במהלך השתלת CIED מ-SAT מעל שריר החזה הראשי (ראו איור 1).הערה: שימוש בכמויות גדולות יותר של SAT טרי מגדיל את התפוקה של hSATMVEC במהלך בידוד ויש לו את הסיכוי הגבוה ביותר לבידוד מוצלח ולתרבית hSATMVEC. יש להכניס מיד את ה-SAT לתמיסת אחסון רקמות של מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) קרה כקרח בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ”ל לפני העברתו למעבדה.הערה: לקבלת הסיכוי הגבוה ביותר לבידוד מוצלח, יש לבצע בידוד hSATMVEC בהקדם האפשרי. עם זאת, ניתן לאחסן SAT עד 24 שעות על קרח לפני הבידוד במידת הצורך. הכינו תמיסת עבודה של 1 מ”ג/מ”ל קולגןאז/דיספאס באופן הבא.ראשית, יש ליצור מחדש 500 מ”ג של אבקת קולגןאז/דיספאס ליופיליזציה ב-5 מ”ל מים סטריליים ליצירת תמיסת מלאי של קולגן/דיספאס בריכוז של 100 מ”ג/מ”ל. עבור כל בידוד hSATMVEC, יש לדלל 100 μL של תמיסת מלאי collagenase/dispase ב-10 מ”ל של תמיסת מלח מאוזן של הנקס′ קרה כדי לקבל תמיסת עבודה של 1 מ”ג/מ”ל. בארון זרימה למינרית, השתמש בשני אזמלים כדי לטחון רקמות לתוך ~ 1 מ”מ3 חתיכות ב 500 μL של 1 מ”ג / מ”ל collagenase / dispase תמיסת על מכסה צלחת פטרי, triturate ולהעביר צינור צנטריפוגה נקי 50 מ”ל. שטפו את מכסה צלחת הפטרי עם 4.5 מ”ל של תמיסת קולגןאז/דיספאס טרייה במינון 1 מ”ג/מ”ל והוסיפו לצינור הצנטריפוגה בנפח 50 מ”ל. השאירו לעיכול למשך 30 דקות ב-37°C במסובב צינור ב-20 סל”ד. עצור את תהליך העיכול על ידי הוספת 10 מ”ל של MV מלא של מדיה גידול EC. שלשו את התערובת המעוכלת והעבירו אותה דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר. יש לשטוף את המסננת ב-10 מ”ל של חיץ אלבומין מסרום בקר (PBS-BSA) בעל מאגר של 0.5% חוצץ פוספט-אלבומין בסרום בקר. צנטריפוגה את הדגימה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה עם עוד 5 מ”ל של 0.5% PBS-BSA. לאחר מכן, הסר את התאים המתים באמצעות ערכה להסרת תאים מתים. כדי לעשות זאת, לדגור על גלולת התא ב 200 μL של חרוזים להסרת תאים מתים (מערבולת לפני השימוש) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ”ל. חבר עמוד LS עם מסנן 30 מיקרומטר למגנט המפריד ומקם צינור צנטריפוגה של 15 מ”ל מתחתיו. שטפו את העמוד המגנטי פעם אחת עם 1 מ”ל של חיץ מחייב להסרת תאים מתים לפני הוספת הדגימה/מתלה החרוזים ואפשרו לו לעבור באופן פסיבי תחת כוח הכבידה. לאחר מכן, לשטוף את העמודה על ידי הוספת 0.5 מ”ל של מאגר מחייב ולאפשר לו לעבור באופן פסיבי דרך העמודה. חזור על שטיפה זו ארבע פעמים. לאסוף את eluate כמו חלק תא חי, לסובב את התאים ב 300 x גרם ב RT במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף ולהשעות מחדש את הגלולה המתקבלת ב 400 μL של 0.5% PBS-BSA. הוסף 20 μL של חרוזים מגנטיים מצופים אנטי CD31 לתאים מרחפים לדגור במשך 20 דקות ב 4 ° C . לאחר הדגירה, צנטריפוגו את הדגימה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT ולהשליך את supernatant. להשהות מחדש את גלולת התא ב 500 μL של 0.5% PBS-BSA. חבר עמוד MS עם מסנן 30 מיקרומטר למגנט המפריד ומקם צינור צנטריפוגה של 15 מ”ל מתחתיו. ראש העמודה עם 500 μL של 0.5% PBS-BSA. חזור על שלב זה פעמיים. הוסיפו את תרחיף התא-מיקרו-חרוזים ואפשרו לו לעבור תחת כוח הכבידה. שטפו את העמוד עם 500 μL של 0.5% PBS-BSA שלוש פעמים. הזרימה בצינור הצנטריפוגה מתחת לעמוד מכילה את שבר CD31. כדי לאסוף את שבר CD31+ (כלומר, החלק המכיל hSATMVECs), הסר את עמודת MS מהמגנט המפריד והנח אותה בצינור צנטריפוגה טרי של 15 מ”ל. הוסף 1 מ”ל של 0.5% PBS-BSA, ובפעולה חלקה אחת, החל את בוכנת העמודה כדי לשחרר את hSATMVECs שנלכדו. צנטריפוגו את הדגימה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT ו להשליך את supernatant. השהה מחדש את גלולת התא ב- 1 מ”ל של מדיה מלאה לגידול EC MV וחלק את תמיסת התא של 1 מ”ל בין באר אחת או שתיים (תלוי בגודל הכדור) של צלחת 24 בארות מצופות ג’לטין 2% (מעבר 0).הערה: אל תדאג אם יש מעט תאים דבקים בימים הראשונים שלאחר הבידוד. החליפו מדיה כל 3 ימים. תאי תרבית ב 37 ° C עם 5% CO2. ברגע שהתאים המבודדים מגיעים ל~80% מפגש (2-4 שבועות), מעבירים אותם לבאר אחת של צלחת בת שש בארות (מעבר 1).הערה: מעברים מאוחרים יותר יכולים לצלחת מחדש תאים מבאר תורם אחת לבארות מקבל. ניסויים בוצעו בתאים של מעבר 2-4 דור לאחר שהתאים הוכיחו טוהר של >99% באמצעות ציטומטריית זרימה (ראה סעיף 3). התאים שמרו על מורפולוגיה אנדותל טיפוסית לפחות עד מעבר 5. 3. ציטומטריית זרימה לפני ציטומטריית זרימה, בדוק חזותית hSATMVECs כדי לוודא שהם נראים חופפים ומייצגים מורפולוגית. בצע הערכה ציטומטרית של זרימה של hSATMVECs במעבר 2, באמצעות תאים מבאר אחת של צלחת 6 בארות. שטפו תאים פעמיים עם PBS על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של PBS היטב ושאיפה בכל פעם. לאחר מכן, הוסף 300 μL / באר של טריפסין חם / EDTA פתרון (0.25%). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 2 דקות. לאחר הניתוק, נטרל תמיסת טריפסין/EDTA עם 700 מיקרוליטר של MV שלם של מדיית גידול EC מלאה והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל. צנטריפוגה את מתלה התא ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב RT. להשליך את supernatant מבלי להפריע את הכדור. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא במאגר MACS של 1 מ”ל ולחלק בין שני צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ”ל המסומנים כבקרה לא מוכתמת ודגימה מוכתמת (500 מיקרוליטר לבאר). הוסף 500 μL נוספים של מאגר MACS לכל צינור מיקרוצנטריפוגה, לפני צנטריפוגה שוב ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב RT. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-100 מיקרוליטר של חיץ MACS לבקרה לא מוכתמת ובקוקטייל צביעה של 100 מיקרוליטר (טבלה משלימה 1) עבור הדגימה המוכתמת. לצבוע את התאים עם CD45-FITC (סמן pan-leucocyte), כמו גם CD144-PE ו CD31-PerCP (אשר מבוטא על ידי תאי אנדותל). מערבלים בקצרה את התאים המרחפים במשך 5 שניות, ואז דוגרים ב 4 ° C במשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 1 מ”ל של חיץ MACS לכל צינור, צנטריפוגה שוב ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב RT, ולזרוק את supernatant. לבסוף, להשעות מחדש את גלולת התא ב 500 μL של מאגר MACS ולהעביר אותו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה טרי 1.5 מ”ל. הניחו את הצינור המסומן בקופסת קרח מכוסה מוכנה לניתוח.הערה: כל ניתוחי ציטומטריית הזרימה שנכללו בוצעו על מערכת ציטומטר זרימה 4-לייזר של Beckman Coulter Cytoflex (באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר בלבד). הגדר את אורך גל הפליטה המרבי ואת המסנן עבור כל fluorochome כדלקמן: CD45-FITC – פליטה מקסימלית 520 ננומטר, מסנן 525/50; CD144-PE – פליטה מקסימלית 578 ננומטר, מסנן 585/40; CD31-PerCP – פליטה מקסימלית 675 ננומטר, מסנן 655-730. כפי שמודגם באיור 2, רשום נתונים עבור 10,000 תאים לדגימה בשער סינגלט (P2). בדוק כי P1 מקיף צביר תאים גדול וכי רוב התאים האלה נופלים בשער סינגלט P2. ודא שלבקרה הלא מוכתמת יש מינימום תאי CD45-CD144+CD31+ כ% מהסינגלט. רשום את אחוז סינגלי התאים CD45-CD144+CD31+ בדגימה המוכתמת. 4. זמן הכפלת תאי אנדותל והתפשטות תאים (איור 3) במעברים 2 ו-3, ספרו את מספר ה-hSATMVECs הקיימים עבור כל דגימה באמצעות המוציטומטריה. רשום את התאריך והשעה של כל ספירת תאים. חישוב מספר הכפלות האוכלוסייה בין נקודות אלה על פי המשוואה: זמן הכפלה = (משך x log(2))/(log (ריכוז סופי)-log(ריכוז התחלתי)).הערה: מחשבון מקוון זמין בכתובת https://doubling-time.com/compute.php. הערך את התפשטות hSATMVECs באמצעות ערכת הדמיה מסחרית להפצת תאים. זרעו hSATMVECs בצפיפות של 20,000 תאים לבאר בצלחת של 24 בארות והשאירו אותם למשך הלילה במדיה מלאה של גידול EC MV כדי להתאושש. למחרת, הוסף 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) לכל מדולל היטב במדיה מלאה EC גידול MV בריכוז סופי של 10 μM. לדגור ב 37 ° C (5% CO2) במשך 2 שעות. הסר את המדיה המכילה EdU ושטוף כל באר פעמיים עם PBS. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות ב- RT. שטוף היטב כל אחד פעמיים עם PBS והוסף 500 μL של 0.5% Triton X-100 במאגר מלח חוצץ טריס (TBS). השאירו לדגור ב-RT למשך 20 דקות.הערה: פעולה זו מחלחלת לקרום התא, ומאפשרת כניסה של אזיד עם תווית Alexa fluor 488 לתוך התא. הכינו את קוקטייל אזיד עם תווית אלקסה 488 בהתאם להוראות היצרן, בהתאם למספר הבארות (ראו6). שטפו היטב פעמיים עם PBS לפני הוספת 100 μL של קוקטייל אזיד עם תווית 488 של Alexa fluor ודגרו במשך 30 דקות ב-RT מוגן מאור.הערה: קוקטייל אזיד עם תווית Alexa fluor 488 מגיב עם ה-EdU בתגובת קליק. הסירו את קוקטייל האזיד עם תווית Alexa fluor 488 ושטפו פעמיים עם PBS. הוסף 500 μL של יודיד פרופידיום לכל באר ודגר במשך 20 דקות ב RT.הערה: שלב זה מכתים גרעינים (גם מתרבים וגם לא מתרבים) באדום.הסר יודיד פרופידיום, שטוף פעמיים עם PBS, ולהשאיר כל באר 500 μL של PBS להדמיה. דמיינו כל באר ב-4 שדות רבי עוצמה בהגדלה של פי 10, עם עירור/פליטה של 495/519 ננומטר עבור אזיד של 488 ננומטר (ראו איור 3C).הערה: התמונות באיורים צולמו באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים בהגדלה של פי 10 עם זמן חשיפה של 800 אלפיות השנייה. ספור את מספר התאים המתרבים (ירוק) ובטא כאחוז (%) מכלל התאים בכל שדה בעוצמה גבוהה (ממוצע של 4 אזורים לבאר). 5. היווצרות צינור תאי אנדותל השאר מטריג’ל (מטריצת קרום מרתף; BMM) כדי להפשיר לילה על קרח. למחרת, עם הצלחת על קרח, להוסיף 160 μL של BMM לכל באר של צלחת 24 באר לפי הצורך. הטה את הצלחת כדי לקבל כיסוי מלא של כל באר עם BMM. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 לקיבוע בעת הכנת התאים. זרע hSATMVECs ב 100,000 תאים (ב 1 מ”ל של מדיה) לכל באר. פיפטה בצד הבאר ודואגים פיפטה לאט כדי למנוע ניתוק מטריצה. לדגור את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 4 שעות.הערה: בשלב זה, הצלחת מוכנה לצילום. התוצאות והנתונים מתחת לדימות הפאזה במערכת ניתוח תאים חיים בהגדלה של פי 10 שימשו ב-5 אזורי בארות שונים (ראו איור 3D). ספור את מספר הצינורות השלמים בכל שדה בהספק גבוה וחשב ערך ממוצע עבור כל דגימה. 6. גירוי אינסולין של hSATMVEC תרבית hSATMVEC בצלחת 6 בארות ב 37 ° C עם 5% CO2. לאחר המפגש, יש להסיר את מצע צמיחת תאי האנדותל המלא MV ולשטוף פעמיים עם PBS. הוסף 500 μL של חומר רעב בסרום (מדיה גידול תאי אנדותל MV ללא תוספים) לכל באר ולהשאיר לדגור ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 4 שעות. במהלך תקופה זו, להכין 500 μL aliquots של ריכוז אינסולין עולה (0-150 μM) מוכן במדיה רעב בסרום. לאחר הרעבת הסרום במשך 4 שעות, הסר מדיה מהבארות, הוסף 1 מ”ל של מדיה המכילה אינסולין (עם ריכוזים הולכים וגדלים) לכל באר, ודגר במשך 10 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2. יש לשטוף פעמיים עם PBS קר לפני הוספת 100 μL של חיץ ליזה חלבוני המכיל פרוטאז ומעכבי פוספטאז לתאי ליז עבור חלבון. כמת את החלבון באמצעות בדיקת BCA.הערה: בניסוי המתואר להלן, ליזטים של תאים הודגרו במשך 30 דקות באמבט קרח וצנטריפוגות במהירות של 20,000 x גרם במשך 15 דקות. לפני האלקטרופורזה, דגימות חלבון הורתחו כדי לנטרל את החלבונים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. החלבונים נפתרו על ג’ל ביס-טריס NuPAGE 4-12% והועברו לקרום ניטרוצלולוז. ניתוח האימונובלוט בוצע על פי פרוטוקולים סטנדרטיים תוך שימוש בנוגדנים רלוונטיים לפוספופרוטאין וסך נוגדני החלבון (בהתאם להוראות היצרן). נעשה שימוש בנוגדן משני מתאים מסוג Ig/HRP כדי לזהות את הנוגדן הראשוני (בהתאם להוראות היצרן). רמות החלבון כומתו באמצעות צפיפות, בהתבסס על עוצמת הפסים מכל דגימה. ß-actin שימש כבקרת טעינה במידת הצורך. 7. הקמת תרבית משותפת hSATMVEC-adipocyte (איור 4) הערה: בתוצאות שלהלן, נעשה שימוש מסחרי בקדם-אדיפוציטים תת-עוריים לבנים אנושיים במעבר 2 מתורם קווקזי זכר יחיד בכל בדיקות האדיפוציטים. פרדיפוציטים הורחבו בתחילה מהבקבוקון שסופק על ידי הספק (מעבר 0) לשנים עשר קריובלים המכילים מדיית הקפאה cryo-SFM (מעבר 1). כל צלחת תרבית משותפת בת 24 בארות דורשת קריוביאל אחד של קדם-אדיפוציטים (מעבר 1). הפשירו במהירות כל בקבוקון וצלחת לתוך בקבוק T75 המכיל 12-15 מ”ל של מדיה PGM-2 חמה (המכילה 10% FBS, 30 מיקרוגרם/מ”ל L-גלוטמין ו-15 ננוגרם/מ”ל GA-1000 SingleQuots). החליפו מדיה כל 3 ימים עד למפגש של 90%. לאחר 90% confluent, לשטוף את preadipocytes תת עורית לבן אנושי עם PBS ולאחר מכן להוסיף 1 מ”ל של תמיסת טריפסין/EDTA (0.25%). להשאיר ב RT במשך 2 דקות ולאשר ניתוק עם מיקרוסקופ אור. הוסף 23 מ”ל של מדיה PGM-2 כדי לנטרל את טריפסין/EDTA וליצור תמיסה מרחפת של 24 מ”ל. שים 1 מ”ל של תמיסת קדם-אדיפוציט לבנה תת-עורית אנושית תלויה בכל באר של צלחת נלווית של תרבית משותפת בת 24 בארות וגדל למפגש (בדרך כלל 2-3 ימים). תוך כדי גדילה למפגש, להכין preadipocyte differentiation media (PDM). כדי להכין PDM, הכינו מלאי PDM כפול על ידי הוספת תערובת קניינית של אינסולין, דקסמתזון, אינדומתצין ואיזובוטיל-מתיל-קסנטין למדיית הבסיס של PGM. יש לדלל שני PDM ביחס של 1:1 עם PGM כדי ליצור PDM אחד. לאחר המפגש, להבדיל את הקדם-אדיפוציטים הלבנים התת-עוריים האנושיים על ידי שינוי מדיה ל -1 מ”ל של מדיה PDM 1x לכל באר (יום 0). השאירו את הקדם-אדיפוציטים הלבנים התת-עוריים האנושיים לדגור ב-37°C 5% CO2 למשך 10 ימים (ללא שינויי מדיה) כדי להבדיל באופן מלא. ניטור התמיינות באמצעות מיקרוסקופ פאזת אור (ראו איור 4B).הערה: לא ניתן להעביר אדיפוציטים מובחנים וניתן להשתמש בהם לבדיקות מהיום ה-10 עד היום ה-12. התמיינות אדיפוציט יכולה להימדד על ידי הגברת mRNA של לפטין, אדיפונקטין ו-PPAR-γ. ביום 6 להתמיינות, זרע hSATMVECs בצפיפות של 5 x 104 תאים לכל החדרה ב 500 μL שלם EC growth media MV על תוספות transwell (0.4 μM ממברנה). מניחים את החדרות הטרנסוול לבאר עם 500 μL של מדיית גידול EC מלאה MV () וגדלים למפגש ב 37 ° C ב 5% CO2. ביום ה-10, כאשר האדיפוציטים מתמיינים לחלוטין, הסירו מחצית ממדיית ה-PDM מכל באר והעבירו את תוספות הטרנסוול המכילות hSATMVEC במדיה שלהם (ECGM-MV) לכל באר (ראו איור 4A). השאירו תאים בתרבית משותפת למשך 24 שעות לפני הסרת תוספות הטרנסוול ובצעו בדיקות המעריכות את תפקוד האדיפוציט.הערה: בנקודת זמן זו, אדיפוציטים יכולים גם להיות lysed עבור חלבון או בידוד RNA במידת הצורך. 8. אדיפוציט 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBD)-ספיגת גלוקוז לאחר 24 שעות בתרבית משותפת, הסר תוספות תאים המכילות hSATMVEC. לאחר מכן, הוסף 2-NBD-גלוקוז למדיה בכל באר כדי להשיג ריכוז סופי של 20 μM. להגן מפני אור לדגור במשך 30 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2. שטפו את התאים פעמיים ב-PBS וקבעו את האדיפוציטים באמצעות 500 μL של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 15 דקות ב-RT. שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS לפני שתעזבו ב-100 מיקרוליטר של PBS.הערה: בשלב זה, האדיפוציטים מוכנים לצילום. באיורים הכלולים, הדמיית פאזה ואור ירוק (עירור 440-480 ננומטר/פליטה 504-544 ננומטר) התקבלו במערכת ניתוח תאים חיים בהגדלה של פי 10 בארבעה שדות רבי עוצמה (ראו איור 4C). כמת את רמת ספיגת הגלוקוז על ידי כימות האחוז הירוק של השטח הכולל באמצעות סף ב- ImageJ (או כל חבילת תוכנה דומה אחרת).