Изучение перекрестных взаимодействий жировых эндотелиальных клеток/адипоцитов в подкожной жировой клетчатке человека

Образцы человеческой ткани, используемые в описанной методике, были взяты у пациентов, которым вводили КИЭД по назначению в соответствии с обычной клинической практикой в Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Лидс, Великобритания). Протокол исследования, наряду со всей остальной документацией, был одобрен местным комитетом по этике (11/YH/0291) до зачисления участников. Исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. 1. Популяция пациентов Получение свежей подкожной жировой клетчатки (SAT) во время имплантации CIED из SAT, расположенного над большой грудной мышцей. Изолируйте образцы SAT в стерильных условиях и обрабатывайте образцы тканей после сбора в колпаке с ламинарным потоком в строгих асептических условиях для предотвращения бактериального загрязнения. 2. Выделение и культивирование эндотелиальных клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Схема изоляции hSATMVEC показана на рисунке 1. Для выделения hSATMVEC используйте не менее 250 мг свежей подкожной жировой ткани (SAT), полученной во время имплантации CIED из SAT, расположенной над большой грудной мышцей (см. Рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Использование большего количества свежего SAT увеличивает выход hSATMVEC во время изоляции и имеет самые высокие шансы на успешную изоляцию и культуру hSATMVEC. Перед передачей в лабораторию немедленно поместите SAT в ледяной раствор для хранения тканей с магнитной активацией и активацией клеток (MACS) в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наибольших шансов на успешную изоляцию hSATMVEC следует провести как можно скорее. Тем не менее, при необходимости SAT может храниться на льду до 24 часов перед изоляцией. Приготовьте рабочий раствор коллагеназы в дозе 1 мг/мл следующим образом.Сначала восстановите 500 мг коллагеназы/диспаза лиофилизированного порошка в 5 мл стерильной воды с образованием стокового раствора коллагеназы/диспазы с концентрацией 100 мг/мл. Для каждого выделения hSATMVEC разведите 100 мкл стокового раствора коллагеназы/диспазы в 10 мл холодного раствора сбалансированной соли Hanks, чтобы получить рабочий раствор 1 мг/мл. В ламинарном шкафу с помощью двух скальпелей измельчите салфетки на ~1 мм3 штуки в 500 мкл 1 мг/мл коллагеназы/раствора на крышке чашки Петри, растирайте и переложите в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Вымойте крышку чашки Петри 4,5 мл свежего раствора коллагеназы/диспазы 1 мг/мл и добавьте в пробирку центрифуги объемом 50 мл. Оставить вариться на 30 минут при температуре 37 °C в вращателе трубок при 20 оборотах в минуту. Остановите процесс разложения, добавив 10 мл полной питательной среды EC MV. Переваренную смесь измельчите и пропустите через ячеистое сито 70 мкм. Промойте сито 10 мл 0,5% буфера фосфатно-солевого буфера – бычьего сывороточного альбумина (PBS-BSA). Центрифугируйте образец при давлении 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг с еще 5 мл 0,5% PBS-BSA. Затем удалите мертвые клетки с помощью набора для удаления мертвых клеток. Для этого клеточную гранулу инкубируют в 200 мкл гранул для удаления мертвых клеток (вихрь перед использованием) в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Присоедините колонку LS с фильтром 30 μм к магниту-сепаратору и поместите под нее центрифужную трубку объемом 15 мл. Промойте магнитную колонку один раз 1 мл связывающего буфера для удаления мертвых клеток перед добавлением суспензии образца/гранул и дайте ей пассивно пройти под действием силы тяжести. Затем промойте колонку, добавив 0,5 мл связующего буфера, и дайте ему пассивно пройти через колонку. Повторите эту стирку четыре раза. Соберите элюат в виде фракции живых клеток, открутите клетки при 300 x g при RT в течение 10 минут, а затем промойте и повторно суспендируйте полученную гранулу в 400 μл 0,5% PBS-BSA. Добавьте 20 мкл магнитных шариков, покрытых анти-CD31, к взвешенным клеткам и инкубируйте в течение 20 мин при 4 °C. После инкубации центрифугируйте образец при давлении 300 x g в течение 5 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл 0,5% PBS-BSA. Прикрепите к магниту-сепаратору колонку MS с фильтром 30 μм и поместите под нее центрифужную трубку объемом 15 мл. Загрунтуйте колонку 500 мкл 0,5% PBS-BSA. Повторите этот шаг дважды. Добавьте клеточно-микрошариковую суспензию и дайте ей пройти под действием силы тяжести. Трижды промыть колонку 500 мкл 0,5% PBS-BSA. Проточный поток в центрифужной трубке под колонной содержит фракцию CD31- . Чтобы собрать фракцию CD31+ (т.е. фракцию, содержащую hSATMVEC), снимите колонку MS с магнита-сепаратора и поместите ее в свежую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 1 мл 0,5% PBS-BSA и одним плавным движением примените поршень колонны, чтобы освободить захваченные hSATMVECs. Центрифугируйте образец при 300 x g в течение 5 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл полной питательной среды EC MV и разделите раствор клетки объемом 1 мл между одной или двумя лунками (в зависимости от размера гранулы) 24-луночного планшета, покрытого 2% желатином (проход 0).ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокойтесь, если в первые несколько дней после изоляции будет мало адгезивных клеток. Меняйте носители каждые 3 дня. Культивирование клеток при 37 °C с 5%CO2. Как только изолированные клетки достигнут ~80% конфлюенции (2-4 недели), пропустите их в одну лунку шестилуночного планшета (проход 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие пассажи могут перестраивать клетки из одной сливающейся донорской лунки в лунки реципиента. Эксперименты проводили на клетках пассажа через 2-4 поколения после того, как клетки показали чистоту >99% с помощью проточной цитометрии (см. раздел 3). Клетки сохраняли типичную эндотелиальную морфологию по крайней мере до 5 пассажа. 3. Проточная цитометрия Перед проведением проточной цитометрии необходимо визуально проверить hSATMVECs, чтобы убедиться, что они выглядят сливающимися и морфологически репрезентативными. Проточную цитометрическую оценку hSATMVECs в пассаже 2 с использованием клеток из одной лунки 6-луночного планшета. Дважды промойте ячейки PBS, хорошо добавив 500 μл PBS и каждый раз отсасывая. Затем добавьте 300 μл/лунку теплого раствора трипсина/ЭДТА (0,25%). Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 минут. После отделения нейтрализуйте раствор трипсина/ЭДТА 700 мкл полной питательной среды EC MV и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте клеточную суспензию при 400 x g в течение 8 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость, не повреждая гранулу. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере MACS объемом 1 мл и разделите между двумя микроцентрифужными пробирками объемом 1,5 мл с маркировкой неокрашенного контроля и окрашенным образцом (500 мкл на лунку). Добавьте еще 500 мкл буфера MACS в каждую микроцентрифужную пробирку перед повторным центрифугированием при 400 x g в течение 8 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл буфера MACS для контроля неокрашенных клеток и 100 мкл окрашивающего коктейля (Дополнительная таблица 1) для окрашенного образца. Окрашивайте клетки CD45-FITC (маркер панлейкоцитов), а также CD144-PE и CD31-PerCP (которые экспрессируются эндотелиальными клетками). Кратковременно переведите взвешенные клетки на вихрь в течение 5 с, затем инкубируйте при 4 °C в течение 10 мин. Затем добавьте 1 мл буфера MACS в каждую пробирку, снова центрифугируйте при 400 x g в течение 8 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость. Наконец, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл буфера MACS и переложите ее в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Поместите пробирку с маркировкой в закрытый ящик для льда, готовый к анализу.ПРИМЕЧАНИЕ: Все включенные анализы проточной цитометрии были выполнены на системе проточного цитометра Beckman Coulter Cytoflex 4-лазерного (с использованием только лазера возбуждения 488 нм). Настройте максимальную длину волны излучения и фильтр для каждой флюорохомы: CD45-FITC – максимальная длина излучения 520 нм, фильтр 525/50; CD144-PE – эмиссия максимальная 578 нм, фильтр 585/40; CD31-PerCP – излучение максимум 675 нм, фильтр 655-730. Как показано на рисунке 2, запишите данные для 10 000 клеток на образец в синглетный вентиль (P2). Убедитесь, что P1 окружает основной кластер клеток и что большинство этих клеток попадает в синглетный вентиль P2. Убедитесь, что неокрашенный контроль содержит минимальное количество CD45-CD144+CD31+ клеток в процентах от синглетов. Запишите процентное содержание синглетов CD45-CD144+CD31+ в окрашенном образце. 4. Время удвоения эндотелиальных клеток и пролиферация клеток (Рисунок 3) В отрывках 2 и 3 подсчитайте количество жизнеспособных hSATMVEC для каждого образца с помощью гемоцитометрии. Запишите дату и время подсчета каждой ячейки. Вычислим количество удвоений популяции между этими точками в соответствии с уравнением: время удвоения = (продолжительность x log(2))/(log (конечная концентрация)-log(начальная концентрация)).ПРИМЕЧАНИЕ: Онлайн-калькулятор доступен по адресу https://doubling-time.com/compute.php. Оцените пролиферацию hSATMVECs с помощью коммерчески доступного набора для визуализации пролиферации клеток. Засейте hSATMVEC с плотностью 20 000 клеток на лунку в 24-луночном планшете и оставьте их на ночь в полной EC питательной среде MV для восстановления. На следующий день добавьте 5-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU) в каждую лунку, разведенную в полной питательной среде EC MV с конечной концентрацией 10 мкМ. Инкубируйте при 37 °C (5%CO2) в течение 2 ч. Удалите фильтрующий материал, содержащий EdU, и дважды промойте каждую лунку PBS. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 15 минут при RT. Дважды промойте каждую лунку PBS и добавьте 500 μл 0,5% Triton X-100 в трис-буферный физиологический раствор (TBS). Оставьте инкубироваться при RT на 20 минут.Примечание: Это пронизывает клеточную мембрану, позволяя азиду Alexa fluor 488 проникать в клетку. Приготовьте азидный коктейль с маркировкой Alexa fluor 488 в соответствии с инструкциями производителя, в зависимости от количества лунок (см.6). Дважды промойте каждую лунку PBS, прежде чем добавить 100 μл азидного коктейля Alexa fluor 488 и инкубируйте в течение 30 минут при RT в защищенном от света месте.ПРИМЕЧАНИЕ: Коктейль из азида, меченный Alexa fluor 488, реагирует с EdU в клик-реакции. Удалите коктейль из азида с маркировкой Alexa fluor 488 и дважды промойте PBS. Добавьте 500 μл йодида пропидия в лунку и инкубируйте в течение 20 минут при RT.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ядра (как пролиферирующие, так и непролиферирующие) окрашиваются в красный цвет.Удалите йодид пропидия, дважды промойте PBS и оставьте каждую лунку в 500 мкл PBS для визуализации. Визуализируйте каждую лунку в 4 мощных полях с 10-кратным увеличением и возбуждением/излучением 495/519 нм для азида 488 нм (см. рис. 3C).ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения на рисунках были получены с помощью системы анализа живых клеток при 10-кратном увеличении и времени экспозиции 800 мс. Подсчитайте количество пролиферирующих клеток (зеленым цветом) и экспрессируйте их в процентах (%) от общего числа клеток в каждом высокомощном поле (в среднем 4 области на лунку). 5. Формирование эндотелиальных клеточных трубок Оставить Матригель (матрица базальной мембраны; BMM) для размораживания в течение ночи на льду. На следующий день, положив планшет на лед, добавьте 160 μL BMM в каждую лунку 24-луночного планшета по мере необходимости. Наклоните пластину, чтобы получить полное покрытие каждой скважины с помощью BMM. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 для затвердевания во время подготовки клеток. Посев hSATMVEC в количестве 100 000 клеток (в 1 мл среды) на лунку. Пипетка находится на краю лунки и старайтесь делать пипетку медленно, чтобы избежать отсоединения матрицы. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 4 часов.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе пластина готова к нанесению изображений. Результаты и рисунки ниже фазовой визуализации на системе анализа живых клеток при 10-кратном увеличении были использованы в 5 различных зонах лунки (см. Рисунок 3D). Подсчитайте количество целых пробирок в каждом поле высокой мощности и рассчитайте среднее значение для каждого образца. 6. Инсулиновая стимуляция hSATMVEC Культивируют hSATMVEC в 6-луночном планшете при 37 °C с 5%CO2. После слияния удалите полную среду роста эндотелиальных клеток MV и дважды промойте PBS. Добавьте 500 μл сыворотки среды для голодания (среда для роста эндотелиальных клеток MV без добавок) в каждую лунку и оставьте инкубироваться при 37 °C с 5%CO2 на 4 ч. За это время готовят 500 мкл аликвот возрастающих концентраций инсулина (0-150 мкМ) в средах для сывороточного голодания. После 4 ч сывороточного голодания удалить среду из лунок, добавить по 1 мл инсулинсодержащей среды (с возрастающей концентрацией) в каждую лунку и инкубировать в течение 10 мин при 37 °С с 5%СО2. Дважды промойте холодной PBS перед добавлением 100 мкл буфера для лизиса белка, содержащего протеазу и ингибиторы фосфатазы, для лизирования клеток на белок. Количественное определение белка с помощью анализа BCA.Примечание: В описанном ниже эксперименте клеточные лизаты инкубировали в течение 30 минут в ледяной бане и центрифугировали при 20 000 x g в течение 15 минут. Перед электрофорезом образцы белков кипятили для денатурации белков при 95 °C в течение 5 минут. Белки растворяли на NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Иммуноблоттинг проводили по стандартным протоколам с использованием соответствующих фосфопротеиновых антител и антител к общему белку (согласно инструкции производителя). Для обнаружения первичного антитела использовали соответствующее вторичное антитело Ig/HRP (в соответствии с инструкциями производителя). Уровни белка количественно определяли с помощью денситометрии на основе интенсивности полос из каждого образца. ß-актин использовался в качестве контроля погрузки там, где это было необходимо. 7. Создание совместного культивирования hSATMVEC и адипоцитов (Рисунок 4) ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенных ниже результатах во всех анализах адипоцитов использовались коммерчески доступные человеческие белые подкожные преадипоциты в пассаже 2 от одного мужчины-донора европеоидной расы. Преадипоциты первоначально были расширены из флакона, предоставленного поставщиком (проход 0), до двенадцати криоциалов, содержащих крио-SFM замораживающую среду (проход 1). Для каждого 24-луночного планшета для совместного культивирования требуется один криовиал преадипоцитов (пассаж 1). Быстро разморозьте каждый флакон и планшет в колбе T75, содержащей 12–15 мл теплой среды PGM-2 (содержащей 10% FBS, 30 мкг/мл L-глутамина и 15 нг/мл GA-1000 SingleQuots). Меняйте носители каждые 3 дня до 90% слияния. После 90% слияния промойте человеческие белые подкожные преадипоциты PBS, а затем добавьте 1 мл раствора трипсина/ЭДТА (0,25%). Оставьте в режиме лучевой терапии на 2 минуты и подтвердите отслойку с помощью световой микроскопии. Добавьте 23 мл среды PGM-2 для нейтрализации трипсина/ЭДТА и получите 24 мл раствора, суспензированного преадипоцитами. Поместите 1 мл суспензии подкожного раствора преадипоцитов человека в каждую лунку 24-луночного планшета-компаньона для совместной культуры и выращивайте до слива (обычно 2-3 дня). По мере роста до слияния готовят преадипоцитарные среды для дифференцировки (ПДМ). Чтобы приготовить ПДМ, приготовьте бульон в 2 раза, добавив запатентованную смесь инсулина, дексаметазона, индометацина и изобутилметилксантина в базовую среду МПГ. Разбавьте 2x PDM в соотношении 1:1 с PGM, чтобы получить 1x PDM. После слияния дифференцируйте подкожные белые преадипоциты человека, изменяя среду на 1 мл 1x PDM среды в каждую лунку (день 0). Оставьте человеческие подкожные белые преадипоциты для инкубации при 37 °C 5%CO2 в течение 10 дней (без смены среды) для полной дифференцировки. Мониторируйте дифференцировку с помощью световой фазовой микроскопии (см. рисунок 4B).Примечание: Дифференцированные адипоциты не могут быть пропущены и могут быть использованы для анализов с 10-го по 12-й день. Дифференцировку адипоцитов можно измерить с помощью мРНК-амплификации лептина, адипонектина и PPAR-γ. На 6-й день дифференцировки семена hSATMVEC плотностью 5 x 104 клетки на вставку в 500 мкл полной EC питательной среды MV на трансвелловых вставках (мембрана 0,4 мкм). Поместите транслуночные вставки в лунку с 500 мкл полной EC питательной среды MV () и вырастите до слияния при 37 °C при 5%CO2. На 10-й день, когда адипоциты будут полностью дифференцированы, удалите половину среды PDM из каждой лунки и перенесите трансманшированные вставки, содержащие конфлюентный hSATMVEC в их собственной среде (ECGM-MV), в каждую лунку (см. рис. 4A). Оставьте клетки в совместном культивировании на 24 часа перед удалением трансвелловых вкладышей и проведите анализы, оценивающие функцию адипоцитов.Примечание: На этом этапе адипоциты также могут быть лизированы для выделения белка или РНК, если это необходимо. 8. Поглощение глюкозы адипоцитами 2-(N-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкозой (2-NBD)-глюкозой Через 24 ч в кокультуре удалить клеточные вставки, содержащие hSATMVEC. Затем добавьте 2-NBD-глюкозу в среду в каждой лунке для достижения конечной концентрации 20 μM. Защитите от света и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C с 5%CO2. Дважды промойте клетки в PBS и зафиксируйте адипоциты с помощью 500 μл 4% параформальдегида (PFA) в течение 15 минут на RT. Промойте клетки три раза в PBS перед выходом в 100 μL PBS.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе адипоциты готовы к визуализации. На включенных рисунках фазовая визуализация и зеленый свет (возбуждение 440-480 нм/излучение 504-544 нм) были получены на системе анализа живых клеток при 10-кратном увеличении в четырех мощных полях (см. Рисунок 4C). Количественно оцените уровень поглощения глюкозы путем количественного определения зеленого процента от общей площади с помощью порогового значения в ImageJ (или любом другом подобном программном пакете).