Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Die Proben von menschlichem Gewebe, die bei der beschriebenen Technik verwendet werden, wurden von Patienten entnommen, die sich gemäß der klinischen Routine im Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Leeds, Vereinigtes Königreich) einer leitlinienindizierten Insertion von CIEDs unterzogen haben. Das Studienprotokoll wurde zusammen mit allen anderen Unterlagen von der lokalen Ethikkommission (11/YH/0291) vor der Aufnahme in die Teilnehmer genehmigt. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt. 1. Patientenpopulation Gewinnung von frischem subkutanem Fettgewebe (SAT) während der CIED-Implantation aus SAT, das über dem Musculus pectoralis major liegt. Isolieren Sie SAT-Proben unter sterilen Bedingungen und behandeln Sie die Gewebeproben nach der Entnahme in einer Laminar-Flow-Haube unter streng aseptischen Bedingungen, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. 2. Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen HINWEIS: Ein Schema für die hSATMVEC-Isolierung ist in Abbildung 1 dargestellt. Für die hSATMVEC-Isolierung verwenden Sie mindestens 250 mg frisches subkutanes Fettgewebe (SAT), das während der CIED-Implantation aus SAT gewonnen wurde, das über dem Musculus pectoralis major liegt (siehe Abbildung 1).HINWEIS: Die Verwendung größerer Mengen frischer SAT erhöht die Ausbeute an hSATMVEC während der Isolierung und hat die höchste Chance auf eine erfolgreiche Isolierung und hSATMVEC-Kultur. Geben Sie SAT sofort in eine eiskalte MACS-Gewebeaufbewahrungslösung (Magnetic-Activated Cell Sorting) in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, bevor Sie es ins Labor bringen.HINWEIS: Um die höchste Chance auf eine erfolgreiche Isolierung zu haben, sollte die hSATMVEC-Isolierung so schnell wie möglich durchgeführt werden. SAT kann jedoch bis zu 24 Stunden auf Eis gelagert werden, bevor es bei Bedarf isoliert wird. Bereiten Sie eine 1 mg/ml Kollagenase/Dispase-Arbeitslösung wie folgt vor.Rekonstituieren Sie zunächst 500 mg lyophilisiertes Kollagenase/Dispase-Pulver in 5 ml sterilem Wasser, um eine Kollagenase/Dispase-Stammlösung mit einer Konzentration von 100 mg/ml zu bilden. Für jede hSATMVEC-Isolierung 100 μl Kollagenase/Dispase-Stammlösung in 10 ml kalter Hanks’ Balanced Salt-Lösung verdünnen, um eine Arbeitslösung von 1 mg/ml zu erhalten. In einem Laminar-Flow-Schrank das Gewebe mit zwei Skalpellen in ~1 mm3 Stücke in 500 μl 1 mg/ml Kollagenase/Dispase-Lösung auf dem Deckel einer Petrischale zerkleinern, verreiben und in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Waschen Sie den Deckel der Petrischale mit 4,5 ml frischer 1 mg/ml-Kollagenase-/Dispaselösung und geben Sie sie in das 50-ml-Zentrifugenröhrchen. 30 min bei 37 °C in einem Röhrchenrotator bei 20 U/min verdauen lassen. Stoppen Sie den Aufschlussprozess durch Zugabe von 10 mL des vollständigen EC-Wachstumsmediums MV. Zerreiben Sie die verdaute Mischung und passieren Sie sie durch ein 70 μm Zellsieb. Spülen Sie das Sieb mit 10 ml 0,5 % phosphatgepufferter Kochsalzlösung – Rinderserumalbuminpuffer (PBS-BSA). Die Probe wird bei 300 x g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit weiteren 5 ml 0,5 % PBS-BSA. Entfernen Sie dann die abgestorbenen Zellen mit einem Kit zur Entfernung toter Zellen. Inkubieren Sie dazu das Zellpellet in 200 μl Totzellenentfernungskügelchen (Vortex vor der Verwendung) für 15 min bei Raumtemperatur (RT) in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Befestigen Sie eine LS-Säule mit einem 30-μm-Filter an dem Separatormagneten und platzieren Sie ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen darunter. Waschen Sie die magnetische Säule einmal mit 1 ml Bindungspuffer zur Entfernung toter Zellen, bevor Sie die Proben-/Bead-Suspension hinzufügen, und lassen Sie sie unter der Schwerkraft passiv passieren. Waschen Sie als Nächstes die Säule, indem Sie 0,5 ml Bindungspuffer hinzufügen, und lassen Sie ihn passiv durch die Säule laufen. Wiederholen Sie diese Wäsche viermal. Sammeln Sie das Eluat als lebende Zellfraktion, drehen Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 300 x g bei RT und waschen und resuspendieren Sie dann das resultierende Pellet in 400 μl 0,5 % PBS-BSA. Geben Sie 20 μl anti-CD31-beschichtete magnetische Kügelchen zu den suspendierten Zellen und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 4 °C. Nach der Inkubation die Probe bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl 0,5 % PBS-BSA. Befestigen Sie eine MS-Säule mit einem 30-μm-Filter an dem Separatormagneten und platzieren Sie ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen darunter. Die Säule wird mit 500 μl 0,5 % PBS-BSA grundiert. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Fügen Sie die Zell-Mikrokügelchen-Suspension hinzu und lassen Sie sie unter der Schwerkraft passieren. Waschen Sie die Säule dreimal mit 500 μl 0,5 % PBS-BSA. Der Durchfluss im Zentrifugenröhrchen unterhalb der Säule enthält die CD31-Fraktion . Um die CD31+ -Fraktion (d. h. die Fraktion, die hSATMVECs enthält) zu sammeln, entfernen Sie die MS-Säule vom Separatormagneten und legen Sie sie in ein frisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 ml 0,5 % PBS-BSA hinzu und setzen Sie den Säulenkolben in einem sanften Arbeitsgang ein, um die eingefangenen hSATMVECs freizusetzen. Die Probe wird bei 300 x g 5 min lang bei RT zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL des kompletten EC-Wachstumsmediums MV und verteilen Sie die 1 mL Zelllösung auf ein oder zwei Wells (je nach Pelletgröße) einer 2 % gelatinebeschichteten 24-Well-Platte (Passage 0).HINWEIS: Machen Sie sich keine Sorgen, wenn es in den ersten Tagen nach der Isolierung nur wenige adhärente Zellen gibt. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage. Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 kultivieren. Sobald die isolierten Zellen eine Konfluenz von ~80 % erreicht haben (2-4 Wochen), werden sie in eine einzelne Vertiefung einer Sechs-Well-Platte (Passage 1) geleitet.HINWEIS: Nachfolgende Passagen können Zellen von einer konfluenten Spendervertiefung in die Empfängervertiefungen neu plattieren. Die Experimente wurden an Zellen der Passage 2-4 der Generation durchgeführt, nachdem die Zellen mittels Durchflusszytometrie eine Reinheit von >99 % gezeigt hatten (siehe Abschnitt 3). Die Zellen behielten die typische endotheliale Morphologie mindestens bis zur Passage 5 bei. 3. Durchflusszytometrie Überprüfen Sie vor der Durchflusszytometrie die hSATMVECs visuell, um sicherzustellen, dass sie konfluent und morphologisch repräsentativ erscheinen. Durchführung einer durchflusszytometrischen Beurteilung von hSATMVECs an Passage 2 unter Verwendung von Zellen aus einer Einzelvertiefung einer 6-Well-Platte. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, indem Sie 500 μl PBS gut zugeben und jedes Mal aspirieren. Geben Sie dann 300 μl/Vertiefung warme Trypsin/EDTA-Lösung (0,25 %) hinzu. Bei 37 °C mit 5 % CO2 2 min inkubieren. Nach dem Ablösen die Trypsin/EDTA-Lösung mit 700 μl vollständigem EC-Wachstumsmedium MV neutralisieren und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Die Zellsuspension bei 400 x g für 8 min bei RT zentrifugieren. Den Überstand verwerfen, ohne das Pellet zu stören. Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL MACS-Puffer und teilen Sie es auf zwei 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf, die mit ungefärbter Kontroll- und gefärbter Probe (500 μl pro Well) beschriftet sind. Geben Sie weitere 500 μl MACS-Puffer in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, bevor Sie erneut bei 400 x g für 8 min bei RT zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 100 μl MACS-Puffer für die ungefärbte Kontrolle und 100 μl Färbecocktail (Ergänzende Tabelle 1) für die gefärbte Probe resuspendieren. Färben Sie die Zellen mit CD45-FITC (dem Pan-Leukozyten-Marker) sowie CD144-PE und CD31-PerCP (die von Endothelzellen exprimiert werden). Die suspendierten Zellen 5 s lang kurz vortexen, dann 10 min bei 4 °C inkubieren. Geben Sie anschließend 1 ml MACS-Puffer in jedes Röhrchen, zentrifugieren Sie erneut bei 400 x g für 8 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand. Zum Schluss resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl MACS-Puffer und überführen es in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie das beschriftete Röhrchen in eine abgedeckte Eisbox, bereit für die Analyse.HINWEIS: Alle enthaltenen Durchflusszytometrie-Analysen wurden mit einem Beckman Coulter Cytoflex 4-Laser-Durchflusszytometersystem durchgeführt (nur mit dem 488-nm-Anregungslaser). Stellen Sie die maximale Emissionswellenlänge und den Filter für jedes Fluorochome wie folgt ein: CD45-FITC – Emissionsmaximum 520 nm, Filter 525/50; CD144-PE – Emissionsmaximum 578 nm, Filter 585/40; CD31-PerCP – Emissionsmaximum 675 nm, Filter 655-730. Wie in Abbildung 2 dargestellt, zeichnen Sie die Daten für 10.000 Zellen pro Probe in einem Singulett-Gate (P2) auf. Überprüfen Sie, ob P1 einen großen Zellcluster umgibt und dass die meisten dieser Zellen in das P2-Singulett-Gate fallen. Stellen Sie sicher, dass das ungefärbte Steuerelement nur minimale CD45-CD144+CD31+-Zellen in % der Singuletts enthält. Erfassen Sie den prozentualen Anteil der CD45-CD144+CD31+-Zellvereinzelungen in der gefärbten Probe. 4. Verdopplungszeit der Endothelzellen und Zellproliferation (Abbildung 3) In den Passagen 2 und 3 ist die Anzahl der lebensfähigen hSATMVECs für jede Probe mittels Hämozytometrie zu zählen. Notieren Sie das Datum und die Uhrzeit jeder Zellzählung. Berechnen Sie die Anzahl der Populationsverdopplungen zwischen diesen Punkten gemäß der Gleichung: Verdopplungszeit = (Dauer x log(2))/(log (Endkonzentration)-log (Anfangskonzentration)).HINWEIS: Ein Online-Rechner ist unter https://doubling-time.com/compute.php verfügbar. Beurteilen Sie die Proliferation von hSATMVECs mit einem kommerziell erhältlichen Bildgebungskit zur Zellproliferation. hSATMVECs werden mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte gesät und über Nacht in vollständigen EC-Wachstumsmedien MV zur Gewinnung belassen. Am nächsten Tag wird jeweils 5-Ethynyl-2′-desoxyuridin (EdU) in jedes gut verdünnte Präparat in vollständigen EC-Wachstumsmedien MV in einer Endkonzentration von 10 μM gegeben. Bei 37 °C (5 % CO2) für 2 h inkubieren. Entfernen Sie das EdU-haltige Medium und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd bei RT. Waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit PBS und fügen Sie 500 μl 0,5 % Triton X-100 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) Puffer hinzu. 20 Minuten bei RT inkubieren lassen.HINWEIS: Dadurch wird die Zellmembran permeabilisiert, wodurch das Eindringen von Alexa Fluor 488-markiertem Azid in die Zelle ermöglicht wird. Bereiten Sie den mit Alexa Fluor 488 markierten Azid-Cocktail gemäß den Anweisungen des Herstellers zu, abhängig von der Anzahl der Vertiefungen (siehe6). Waschen Sie jede Mulde zweimal mit PBS, bevor Sie 100 μl Alexa Fluor 488-markierten Azid-Cocktail hinzufügen und 30 Minuten lang bei RT lichtgeschützt inkubieren.HINWEIS: Der mit Alexa Fluor 488 markierte Azid-Cocktail reagiert mit dem EdU in einer Klickreaktion. Entfernen Sie den mit Alexa Fluor 488 markierten Azid-Cocktail und waschen Sie ihn zweimal mit PBS. Fügen Sie 500 μl Propidiumiodid pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei RT.HINWEIS: Dieser Schritt färbt Zellkerne (sowohl proliferierende als auch nicht proliferierende Zellkerne) rot.Entfernen Sie Propidiumiodid, waschen Sie es zweimal mit PBS und belassen Sie jede Vertiefung in 500 μl PBS für die Bildgebung. Bilden Sie jede Vertiefung in 4 Hochleistungsfeldern bei 10-facher Vergrößerung ab, mit 495/519 nm Anregung/Emission für das 488 nm Azid (siehe Abbildung 3C).HINWEIS: Die Bilder in den Abbildungen wurden mit einem Lebendzellanalysesystem bei 10-facher Vergrößerung und einer Belichtungszeit von 800 ms aufgenommen. Zählen Sie die Anzahl der proliferierenden Zellen (grün) und drücken Sie sie als Prozentsatz (%) der Gesamtzellen innerhalb jedes Hochleistungsfeldes aus (durchschnittlich 4 Regionen pro Well). 5. Bildung von Endothelzellröhren Lassen Sie Matrigel (Basalmembranmatrix; BMM) zum Auftauen über Nacht auf Eis. Geben Sie am nächsten Tag, wenn die Platte auf Eis ist, je nach Bedarf 160 μl BMM in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Kippen Sie die Platte, um eine vollständige Abdeckung jeder Vertiefung mit BMM zu erhalten. Die Platte wird in einen Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gestellt, um sie während der Vorbereitung der Zellen fest zu machen. Aussaat von hSATMVECs in einer Menge von 100.000 Zellen (in 1 ml Medium) pro Well. Pipettieren Sie an der Seite der Vertiefung und pipettieren Sie langsam, um ein Ablösen der Matrize zu vermeiden. Die Platte bei 37 °C mit 5 % CO2 4 h inkubieren.HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Platte abgebildet werden. Die Ergebnisse und Abbildungen unten in der Phasenbildgebung auf dem Lebendzellanalysesystem bei 10-facher Vergrößerung wurden in 5 verschiedenen Well-Bereichen verwendet (siehe Abbildung 3D). Zählen Sie die Anzahl der ganzen Röhren in jedem Hochleistungsfeld und berechnen Sie einen Durchschnittswert für jede Probe. 6. Insulinstimulation von hSATMVEC HSATMVEC wird in einer 6-Well-Platte bei 37 °C mit 5 % CO2 kultiviert. Sobald es konfluiert ist, entfernen Sie das komplette Endothelzellwachstumsmedium MV und waschen Sie es zweimal mit PBS. 500 μl Serum-Hungermedium (Endothelzell-Wachstumsmedium MV ohne Zusätze) in jede Vertiefung geben und bei 37 °C mit 5 % CO2 4 h inkubieren lassen. Während dieser Zeit werden 500 μl Aliquots mit steigenden Insulinkonzentrationen (0-150 μM) hergestellt, die in Serummangelmedien hergestellt wurden. Nach 4-stündigem Serumhunger wird das Medium aus den Vertiefungen entfernt, 1 ml insulinhaltiges Medium (mit zunehmender Konzentration) in jede Vertiefung gegeben und 10 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Zweimal mit kaltem PBS waschen, bevor 100 μl Proteinlysepuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren hinzugefügt werden, um die Zellen für Protein zu lysieren. Quantifizieren Sie das Protein mit dem BCA-Assay.HINWEIS: In dem unten beschriebenen Experiment wurden Zelllysate 30 Minuten lang in einem Eisbad inkubiert und 15 Minuten lang bei 20.000 x g zentrifugiert. Vor der Elektrophorese wurden Proteinproben gekocht, um die Proteine bei 95 °C für 5 min zu denaturieren. Die Proteine wurden auf einem NuPAGE 4-12% Bis-Tris-Gel aufgelöst und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Immunoblot-Analyse wurde gemäß Standardprotokollen unter Verwendung relevanter Phosphoprotein-Antikörper und Gesamtprotein-Antikörper (gemäß den Anweisungen des Herstellers) durchgeführt. Zum Nachweis des Primärantikörpers wurde ein geeigneter Ig/HRP-Sekundärantikörper verwendet (gemäß den Anweisungen des Herstellers). Die Proteingehalte wurden mittels Densitometrie auf der Grundlage der Intensität der Banden aus jeder Probe quantifiziert. Gegebenenfalls wurde ß-Aktin als Belastungskontrolle verwendet. 7. Aufbau einer hSATMVEC-Adipozyten-Kokultur (Abbildung 4) HINWEIS: In den folgenden Ergebnissen wurden kommerziell erhältliche humane weiße subkutane Präadipozyten bei Passage 2 von einem einzigen männlichen kaukasischen Spender in allen Adipozyten-Assays verwendet. Die Präadipozyten wurden zunächst von dem vom Anbieter gelieferten Fläschchen (Passage 0) in zwölf Kryofläschchen mit Kryo-SFM-Gefriermedien (Passage 1) expandiert. Jede 24-Well-Co-Kulturplatte benötigt ein Kryofläschchen mit Präadipozyten (Passage 1). Tauen Sie jedes Fläschchen und jede Platte schnell in einem T75-Kolben auf, der 12-15 ml warmes PGM-2-Medium enthält (mit 10 % FBS, 30 μg/ml L-Glutamin und 15 ng/ml GA-1000 SingleQuots). Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage, bis 90 % zusammenfließen. Sobald 90 % konfluiert sind, waschen Sie die menschlichen weißen subkutanen Präadipozyten mit PBS und fügen Sie dann 1 ml Trypsin/EDTA-Lösung (0,25 %) hinzu. Lassen Sie es 2 Minuten bei RT und bestätigen Sie die Ablösung mit Lichtmikroskopie. Fügen Sie 23 ml PGM-2-Medium hinzu, um das Trypsin/EDTA zu neutralisieren, und stellen Sie eine 24 ml Präadipozyten-suspendierte Lösung her. Geben Sie 1 ml suspendierte humane subkutane weiße Präadipozytenlösung in jede Vertiefung einer 24-Well-Co-Kultur-Begleitplatte und wachsen Sie bis zur Konfluenz (normalerweise 2-3 Tage). Während des Wachstums zur Konfluenz bereiten Sie Präadipozyten-Differenzierungsmedien (PDM) vor. Um PDM herzustellen, stellen Sie eine 2x PDM-Brühe her, indem Sie eine proprietäre Mischung aus Insulin, Dexamethason, Indomethacin und Isobutylmethylxanthin zu PGM-Basismedien hinzufügen. Verdünnen Sie 2x PDM im Verhältnis 1:1 mit PGM, um 1x PDM herzustellen. Sobald sie zusammenfließen, differenzieren Sie die menschlichen subkutanen weißen Präadipozyten, indem Sie das Medium auf 1 ml 1x PDM-Medium in jede Vertiefung wechseln (Tag 0). Lassen Sie die subkutanen weißen Präadipozyten des Menschen 10 Tage lang bei 37 °C 5 % CO2 (ohne Medienwechsel) inkubieren, um sich vollständig zu differenzieren. Überwachen Sie die Differenzierung mit Hilfe der Lichtphasenmikroskopie (siehe Abbildung 4B).HINWEIS: Differenzierte Adipozyten können nicht passageiert werden und können für Assays von Tag 10 bis Tag 12 verwendet werden. Die Adipozytendifferenzierung kann durch mRNA-Amplifikation von Leptin, Adiponektin und PPAR-γ gemessen werden. Am Tag 6 der Differenzierung seedete hSATMVECs mit einer Dichte von 5 x 104 Zellen pro Insert in 500 μL vollständigen EC-Wachstumsmedien MV auf Transwell-Inserts (0,4 μM Membran). Die Transwell-Einsätze werden in eine Vertiefung mit 500 μl vollständigem EC-Wachstumsmedium MV () gegeben und wachsen bis zum Zusammenfluss bei 37 °C in 5 % CO2. An Tag 10, wenn die Adipozyten vollständig differenziert sind, entfernen Sie die Hälfte des PDM-Mediums aus jedem Well und übertragen Sie die Transwell-Inserts, die konfluentes hSATMVEC in einem eigenen Medium (ECGM-MV) enthalten, in jedes Well (siehe Abbildung 4A). Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang in Co-Kultur, bevor Sie die Transwell-Inserts entfernen, und führen Sie Assays zur Beurteilung der Adipozytenfunktion durch.HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können Adipozyten bei Bedarf auch für die Protein- oder RNA-Isolierung lysiert werden. 8. Aufnahme von Adipozyten 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-Desoxyglucose(2-NBD)-glucose Nach 24 Stunden in Co-Kultur werden Zellinserts, die hSATMVEC enthalten, entfernt. Geben Sie anschließend 2-NBD-Glukose in das Medium in jeder Vertiefung, um eine Endkonzentration von 20 μM zu erreichen. Vor Licht schützen und 30 min bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS und fixieren Sie die Adipozyten mit 500 μl 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 Minuten bei RT. Waschen Sie die Zellen dreimal in PBS, bevor Sie sie in 100 μl PBS belassen.HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sind die Adipozyten bereit für die Abbildung. In den eingeschlossenen Abbildungen wurden Phasenbildgebung und grünes Licht (Anregung 440-480 nm/Emission 504-544 nm) auf dem Lebendzellanalysesystem bei 10-facher Vergrößerung in vier Hochleistungsfeldern aufgenommen (siehe Abbildung 4C). Quantifizieren Sie den Grad der Glukoseaufnahme, indem Sie den prozentualen Grünanteil der Gesamtfläche unter Verwendung des Schwellenwerts in ImageJ (oder einem anderen ähnlichen Softwarepaket) quantifizieren.