İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Tarif edilen teknikte kullanılan insan dokusu örnekleri, Leeds Eğitim Hastaneleri NHS Trust’ta (Leeds, Birleşik Krallık) rutin klinik uygulamaya göre CIED’lerin kılavuzda belirtilen yerleştirilmesi uygulanan hastalardan alınmıştır. Çalışma protokolü, diğer tüm belgelerle birlikte, katılımcı kaydından önce yerel etik kurul (11/YH/0291) tarafından onaylanmıştır. Çalışma, Helsinki Bildirgesi’nin ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. 1. Hasta popülasyonu Pektoralis majör kasının üzerindeki SAT’tan CIED implantasyonu sırasında taze deri altı yağ dokusu (SAT) elde edin. SAT numunelerini steril koşullar altında izole edin ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için katı aseptik koşullar altında laminer akış başlığında toplandıktan sonra doku numunelerini işleyin. 2. Endotel hücre izolasyonu ve kültürü NOT: hSATMVEC izolasyonu için bir şema Şekil 1’de gösterilmiştir. hSATMVEC izolasyonu için, pektoralis majör kasının üzerindeki SAT’den CIED implantasyonu sırasında elde edilen en az 250 mg taze deri altı yağ dokusu (SAT) kullanın (bkz. Şekil 1).NOT: Daha büyük miktarlarda taze SAT kullanmak, izolasyon sırasında hSATMVEC verimini artırır ve başarılı izolasyon ve hSATMVEC kültürü için en yüksek şansa sahiptir. SAT’ı laboratuvara aktarmadan önce hemen 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde buz gibi soğuk manyetik ile aktive edilen hücre ayırma (MACS) doku saklama solüsyonuna yerleştirin.NOT: Başarılı izolasyon şansının en yüksek olması için hSATMVEC izolasyonu mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır. Bununla birlikte, SAT, gerekirse izolasyondan önce buz üzerinde 24 saate kadar saklanabilir. Aşağıdaki gibi 1 mg / mL kollajenaz / dispas çalışma solüsyonu hazırlayın.İlk olarak, 100 mg / mL konsantrasyonda bir kollajenaz / dispas stok çözeltisi oluşturmak için 5 mL steril su içinde 500 mg kollajenaz / dispas liyofilize tozu yeniden sulandırın. Her hSATMVEC izolasyonu için, 1 mg / mL’lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için 10 μL kollajenaz / dispas stok çözeltisini 10 mL soğuk Hanks’in Dengeli Tuz çözeltisi içinde seyreltin. Laminer akış kabininde, dokuları bir Petri kabının kapağında 500 μL 1 mg / mL kollajenaz / dispas çözeltisi içinde ~ 1 mm3 parçaya doğramak için iki neşter kullanın, tritüre edin ve temiz bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Petri kabı kapağını 4.5 mL taze 1 mg / mL kollajenaz / dispas çözeltisi ile yıkayın ve 50 mL santrifüj tüpüne ekleyin. 20 rpm’de bir tüp döndürücüde 37 °C’de 30 dakika sindirilmeye bırakın. 10 mL tam EC büyüme ortamı MV ekleyerek sindirim sürecini durdurun. Sindirilmiş karışımı ezin ve 70 μm’lik bir hücre süzgecinden geçirin. Elek 10 mL% 0.5 fosfat tamponlu salin – sığır serum albümini (PBS-BSA) tamponu ile durulayın. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g’da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bu adımı başka bir 5 mL %0,5 PBS-BSA ile tekrarlayın. Ardından, bir ölü hücre temizleme kiti kullanarak ölü hücreleri çıkarın. Bunu yapmak için, hücre peletini 200 μL ölü hücre çıkarma boncuklarında (kullanımdan önce girdap) 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin. Ayırıcı mıknatısa 30 μm filtreli bir LS sütunu takın ve altına 15 mL’lik bir santrifüj tüpü yerleştirin. Numune/boncuk süspansiyonunu eklemeden önce manyetik sütunu 1 mL ölü hücre giderme bağlayıcı tamponu ile bir kez yıkayın ve yerçekimi altında pasif olarak geçmesine izin verin. Daha sonra, 0,5 mL bağlayıcı tampon ekleyerek sütunu yıkayın ve sütundan pasif olarak geçmesine izin verin. Bu yıkamayı dört kez tekrarlayın. Elüatı canlı hücre fraksiyonu olarak toplayın, hücreleri RT’de 300 x g’da 10 dakika döndürün ve ardından elde edilen peleti 400 μL% 0.5 PBS-BSA’da yıkayın ve yeniden süspanse edin. Süspanse edilmiş hücrelere 20 μL anti-CD31 kaplı manyetik boncuk ekleyin ve 4 ° C’de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası, numuneyi RT’de 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini 500 μL% 0.5 PBS-BSA’da yeniden süspanse edin. Ayırıcı mıknatısa 30 μm filtreli bir MS sütunu takın ve altına 15 mL’lik bir santrifüj tüpü yerleştirin. Sütunu 500 μL %0,5 PBS-BSA ile astarlayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Hücre mikroboncuk süspansiyonunu ekleyin ve yerçekimi altında geçmesine izin verin. Kolonu 500 μL %0,5 PBS-BSA ile üç kez yıkayın. Kolonun altındaki santrifüj tüpündeki akış, CD31- fraksiyonunu içerir. CD31+ fraksiyonunu (yani hSATMVEC’leri içeren fraksiyonu) toplamak için, MS kolonunu ayırıcı mıknatıstan çıkarın ve 15 mL’lik yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirin. 1 mL %0,5 PBS-BSA ekleyin ve tek bir yumuşak hareketle, yakalanan hSATMVEC’leri serbest bırakmak için sütun pistonunu uygulayın. Numuneyi RT’de 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini 1 mL tam EC büyüme ortamı MV içinde yeniden süspanse edin ve 1 mL hücre solüsyonunu% 2 jelatin kaplı 24 oyuklu bir plakanın (Pasaj 0) bir veya iki oyuğuna (pelet boyutuna bağlı olarak) bölün.NOT: İzolasyondan sonraki ilk birkaç gün içinde az sayıda yapışık hücre varsa endişelenmeyin. Medyayı her 3 günde bir değiştirin. 37 ° C’de% 5 CO2 ile kültür hücreleri. İzole edilmiş hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştığında (2-4 hafta), bunları altı oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna geçirin (geçiş 1).NOT: Sonraki pasajlar, hücreleri bir birleşik donör kuyusundan alıcı kuyucuklarına yeniden plakalayabilir. Deneyler, hücreler akış sitometrisi kullanılarak %>99 saflık gösterdikten sonra 2-4 nesil geçiş hücrelerinde gerçekleştirilmiştir (bkz. bölüm 3). Hücreler, en az 5. pasaja kadar tipik endotel morfolojisini korudu. 3. Akış sitometrisi Akış sitometrisinden önce, birleşik ve morfolojik olarak temsili göründüklerinden emin olmak için hSATMVEC’leri görsel olarak kontrol edin. 6 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğundan alınan hücreleri kullanarak, 2. pasajda hSATMVEC’lerin akış sitometrik değerlendirmesini gerçekleştirin. 500 μL PBS kuyusu ekleyerek ve her seferinde aspire ederek hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra 300 μL / kuyu ılık tripsin / EDTA (% 0.25) çözeltisi ekleyin. 37 ° C’de% 5 CO2 ile 2 dakika inkübe edin. Ayrıldıktan sonra, tripsin / EDTA çözeltisini 700 μL tam EC büyüme ortamı MV ile nötralize edin ve 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu RT’de 8 dakika boyunca 400 x g’da santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı atın. Daha sonra, hücre peletini 1 mL MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve lekesiz kontrol ve lekeli numune (kuyu başına 500 μL) etiketli iki 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü arasında bölün. RT’de 8 dakika boyunca 400 x g’da tekrar santrifüjlemeden önce her bir mikrosantrifüj tüpüne ek 500 μL MACS tamponu ekleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini lekesiz kontrol için 100 μL MACS tamponunda ve lekeli numune için 100 μL boyama kokteylinde (Ek Tablo 1) yeniden süspanse edin. Hücreleri CD45-FITC (pan-lökosit belirteci) ve ayrıca CD144-PE ve CD31-PerCP (endotel hücreleri tarafından eksprese edilir) ile boyayın. Askıda kalan hücreleri 5 saniye kısaca vorteksleyin, ardından 4 ° C’de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, her tüpe 1 mL MACS tamponu ekleyin, RT’de 8 dakika boyunca 400 x g’da tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Son olarak, hücre peletini 500 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve 1.5 mL’lik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Etiketli tüpü analiz için hazır kapalı bir buz kutusuna yerleştirin.NOT: Dahil edilen tüm akış sitometrisi analizleri, bir Beckman Coulter Cytoflex 4 lazerli akış sitometresi sisteminde (yalnızca 488 nm uyarma lazeri kullanılarak) gerçekleştirildi. Her bir florofor için maksimum emisyon dalga boyunu ve filtreyi aşağıdaki gibi ayarlayın: CD45-FITC – emisyon maksimum 520 nm, filtre 525/50; CD144-PE – emisyon maksimum 578 nm, filtre 585/40; CD31-PerCP – emisyon maksimum 675 nm, filtre 655-730. Şekil 2’de gösterildiği gibi, tek bir kapıda (P2) örnek başına 10.000 hücre için veri kaydedin. P1’in büyük bir hücre kümesini çevrelediğini ve bu hücrelerin çoğunun P2 singlet kapısına düştüğünü kontrol edin. Boyanmamış kontrolün, singletlerin yüzdesi olarak minimum CD45-CD144 + CD31 + hücrelerine sahip olduğundan emin olun. Lekeli numunedeki CD45-CD144 + CD31 + hücre tekillerinin yüzdesini kaydedin. 4. Endotel hücre ikiye katlanma süresi ve hücre proliferasyonu (Şekil 3) 2. ve 3. pasajlarda, hemositometri kullanarak her numune için uygun hSATMVEC’lerin sayısını sayın. Her hücre sayımının tarihini ve saatini kaydedin. Bu noktalar arasındaki popülasyon ikiye katlanma sayısını denkleme göre hesaplayın: ikiye katlama süresi = (süre x log(2))/(log (son konsantrasyon)-log(başlangıç konsantrasyonu)).NOT: https://doubling-time.com/compute.php’da çevrimiçi bir hesap makinesi mevcuttur. Ticari olarak temin edilebilen bir hücre proliferasyonu görüntüleme kiti kullanarak hSATMVEC’lerin proliferasyonunu değerlendirin. hSATMVEC’leri 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 20.000 hücre yoğunluğunda tohumlayın ve iyileşmeleri için gece boyunca tam EC büyüme ortamı MV’sinde bırakın. Ertesi gün, 10 μM’lik bir nihai konsantrasyonda tam EC büyüme ortamı MV içinde seyreltilmiş her bir kuyucuğa 5-Etinil-2′-deoksiüridin (EdU) ekleyin. 37 ° C’de (% 5 CO2) 2 saat inkübe edin. EdU içeren ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri RT’de 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Her kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın ve tris tamponlu salin (TBS) tamponuna 500 μL% 0.5 Triton X-100 ekleyin. RT’de 20 dakika inkübe etmeye bırakın.NOT: Bu, hücre zarına nüfuz ederek Alexa fluor 488 etiketli azidin hücreye girmesine izin verir. Alexa fluor 488 etiketli azid kokteylini, kuyu sayısına bağlı olarak üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bkz.6). 100 μL Alexa fluor 488 etiketli azid kokteyli eklemeden önce her bir kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın ve RT’de ışıktan koruyarak 30 dakika inkübe edin.NOT: Alexa fluor 488 etiketli azid kokteyli, bir tıklama reaksiyonunda EdU ile reaksiyona girer. Alexa fluor 488 etiketli azid kokteylini çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Kuyucuk başına 500 μL propidyum iyodür ekleyin ve RT’de 20 dakika inkübe edin.NOT: Bu adım, çekirdekleri (hem çoğalan hem de çoğalmayan) kırmızıya boyar.Probidyum iyodürü çıkarın, PBS ile iki kez yıkayın ve görüntüleme için her kuyucuğu 500 μL PBS’de bırakın. 488 nm azid için 495/519 nm uyarma/emisyon ile 10x büyütmede 4 yüksek güçlü alanda her bir kuyucuğu görüntüleyin (bkz. Şekil 3C).NOT: Şekillerdeki görüntüler, 800 ms pozlama süresi ile 10x büyütmede canlı hücre analiz sistemi kullanılarak çekilmiştir. Çoğalan hücrelerin sayısını (yeşil) sayın ve her yüksek güçlü alandaki toplam hücrelerin yüzdesi (%) olarak ifade edin (kuyu başına ortalama 4 bölge). 5. Endotel hücre tüpü oluşumu Matrigel’i bırakın (bazal membran matrisi; BMM) gece boyunca buz üzerinde buzunu çözmek için. Ertesi gün, plaka buz üzerindeyken, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna gerektiği gibi 160 μL BMM ekleyin. BMM ile her kuyuyu tam olarak kaplamak için plakayı eğin. Hücreleri hazırlarken ayarlamak için% 5 CO2 ile plakayı 37 ° C’de bir inkübatöre yerleştirin. Tohum hSATMVEC’leri kuyu başına 100.000 hücrede (1 mL ortamda). Kuyunun yan tarafına pipetleyin ve matrisin ayrılmasını önlemek için yavaşça pipetlemeye dikkat edin. Plakayı 37 ° C’de% 5 CO2 ile 4 saat inkübe edin.NOT: Bu noktada, plaka görüntülenmeye hazırdır. Canlı hücre analiz sisteminde 10x büyütmede faz görüntülemenin altındaki sonuçlar ve şekiller 5 farklı kuyu alanında kullanılmıştır (bkz. Şekil 3D). Her bir yüksek güç alanındaki tüm tüplerin sayısını sayın ve her numune için ortalama bir değer hesaplayın. 6. hSATMVEC’in insülin stimülasyonu % 5 CO2 ile 37 ° C’de 6 oyuklu bir plakada hSATMVEC kültürü. Bir kez birleştikten sonra, tam endotel hücre büyüme ortamı MV’yi çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Her oyuğa 500 μL serum açlık ortamı (takviyesiz endotel hücre büyüme ortamı MV) ekleyin ve 4 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C’de inkübe etmeye bırakın. Bu süre zarfında, serum açlık ortamında hazırlanan 500 μL’lik artan insülin konsantrasyonları (0-150 μM) hazırlayın. 4 saat boyunca serum aç bırakıldıktan sonra, ortamı kuyucuklardan çıkarın, her oyuğa 1 mL insülin içeren ortam (artan konsantrasyonlarda) ekleyin ve% 5 CO2 ile 37 ° C’de 10 dakika inkübe edin. Protein için liz hücrelerine proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 100 μL protein lizis tamponu eklemeden önce soğuk PBS ile iki kez yıkayın. BCA tahlili kullanarak proteini ölçün.NOT: Aşağıda açıklanan deneyde, hücre lizatları bir buz banyosunda 30 dakika inkübe edildi ve 15 dakika boyunca 20.000 x g’da santrifüjlendi. Elektroforezden önce, protein numuneleri, proteinleri 95 ° C’de 5 dakika boyunca denatüre etmek için kaynatıldı. Proteinler bir NuPAGE %4-12 Bis-Tris Jel üzerinde çözüldü ve bir nitroselüloz membrana aktarıldı. İmmünoblot analizi, ilgili fosfoprotein antikorları ve toplam protein antikorları (üreticinin talimatlarına göre) kullanılarak standart protokollere göre gerçekleştirildi. Primer antikoru tespit etmek için uygun bir Ig/HRP sekonder antikoru kullanıldı (üreticinin talimatlarına göre). Protein seviyeleri, her bir numuneden alınan bantların yoğunluğuna dayalı olarak dansitometri kullanılarak ölçüldü. Uygun olduğunda yükleme kontrolü olarak ß-aktin kullanıldı. 7. hSATMVEC-adiposit ko-kültür kurulumu (Şekil 4) NOT: Aşağıdaki sonuçlarda, tüm adiposit testlerinde tek bir erkek Kafkas donöründen alınan 2. pasajda ticari olarak temin edilebilen insan beyaz deri altı preadipositleri kullanılmıştır. Preadipositler başlangıçta satıcı tarafından sağlanan flakondan (pasaj 0) kriyo-SFM dondurma ortamı içeren on iki kriyoviyal (pasaj 1) genişletildi. Her 24 oyuklu ko-kültür plakası, bir kriyoviyal preadiposit gerektirir (pasaj 1). Her bir şişeyi ve plakayı 12-15 mL ılık PGM-2 ortamı (% 10 FBS, 30 μg / mL L-glutamin ve 15 ng / mL GA-1000 SingleQuots içeren) içeren bir T75 şişesine hızla çözün. birleşene kadar medyayı her 3 günde bir değiştirin. % 90 birleştiğinde, insan beyaz deri altı preadipositlerini PBS ile yıkayın ve ardından 1 mL tripsin / EDTA çözeltisi (% 0.25) ekleyin. RT’de 2 dakika bekletin ve ışık mikroskobu ile ayrılmayı onaylayın. Tripsin / EDTA’yı nötralize etmek için 23 mL PGM-2 ortamı ekleyin ve 24 mL preadiposit süspanse edilmiş bir çözelti yapın. 24 oyuklu bir ko-kültür eşlik eden plakanın her bir oyuğuna 1 mL askıda insan deri altı beyaz preadiposit çözeltisi koyun ve birleşene kadar büyütün (genellikle 2-3 gün). Birleşim noktasına kadar büyürken, preadiposit farklılaşma ortamı (PDM) hazırlayın. PDM’yi hazırlamak için, PGM baz ortamına tescilli bir insülin, deksametazon, indometazin ve izobütil-metilksantin karışımı ekleyerek 2x PDM stoğu yapın. 1x PDM yapmak için 2x PDM’yi PGM ile 1:1 oranında seyreltin. Bir kez birleştikten sonra, ortamı her bir oyuğa 1 mL 1x PDM ortamına değiştirerek insan deri altı beyaz preadipositlerini ayırt edin (Gün 0). İnsan deri altı beyaz preadipositlerini tamamen farklılaşması için 37 ° C% 5 CO2’de 10 gün boyunca (ortam değişiklikleri olmadan) inkübe etmeye bırakın. Işık fazı mikroskobu kullanarak farklılaşmayı izleyin (bkz. Şekil 4B).NOT: Farklılaşmış adipositler pasajlanamaz ve 10. günden 12. güne kadar testler için kullanılabilir. Adiposit farklılaşması, leptin, adiponektin ve PPAR-γ’nin mRNA amplifikasyonu ile ölçülebilir. Farklılaşmanın 6. gününde, transwell ekler (0.4 μM membran) üzerinde 500 μL’lik tam EC büyüme ortamı MV’sinde insert başına 5 x 104 hücre yoğunluğunda tohum hSATMVEC’ler. Transwell eklerini 500 μL tam EC büyüme ortamı MV () içeren bir kuyuya yerleştirin ve 37 °C’de %5 CO 2 ile birleşene kadar büyütün. 10. günde, adipositler tamamen farklılaştığında, her bir oyuktan PDM ortamının yarısını çıkarın ve kendi ortamlarında (ECGM-MV) birleşik hSATMVEC içeren transwell eklerini her bir oyuğa aktarın (bkz. Şekil 4A). Transwell eklerini çıkarmadan önce hücreleri 24 saat ko-kültürde bırakın ve adiposit fonksiyonunu değerlendiren testler yapın.NOT: Bu zaman noktasında, adipositler gerekirse protein veya RNA izolasyonu için de parçalanabilir. 8. Adiposit 2- (N- (7-Nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-il) Amino) -2-Deoksiglukoz (2-NBD) -glikoz alımı Ko-kültürde 24 saat sonra, hSATMVEC içeren hücre eklerini çıkarın. Daha sonra, 20 μM’lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her bir oyuktaki ortama 2-NBD-glikoz ekleyin. Işıktan koruyun ve% 5 CO2 ile 37 ° C’de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS’de iki kez yıkayın ve RT’de 15 dakika boyunca 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) kullanarak adipositleri sabitleyin. 100 μL PBS’de bırakmadan önce hücreleri PBS’de üç kez yıkayın.NOT: Bu noktada, adipositler görüntülenmeye hazırdır. Dahil edilen şekillerde, faz görüntüleme ve yeşil ışık (uyarma 440-480 nm / emisyon 504-544 nm), dört yüksek güçlü alanda 10x büyütmede canlı hücre analiz sisteminde elde edilmiştir (bkz. Şekil 4C). ImageJ’de (veya başka bir benzer yazılım paketinde) eşikleme kullanarak toplam alanın yeşil yüzdesini ölçerek glikoz alım seviyesini ölçün.