Bestudering van overspraak van vet-endotheelcellen en adipocyten in menselijk onderhuids vetweefsel

De monsters van menselijk weefsel die in de beschreven techniek zijn gebruikt, zijn genomen van patiënten die volgens de routinematige klinische praktijk CIED’s invoegen volgens de routinematige klinische praktijk in Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Leeds, Verenigd Koninkrijk). Het onderzoeksprotocol, samen met alle andere documentatie, werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie (11/YH/0291) voorafgaand aan de inschrijving van de deelnemers. Het onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki. 1. Patiëntenpopulatie Verkrijg vers onderhuids vetweefsel (SAT) tijdens CIED-implantatie van SAT dat over de grote borstspier ligt. Isoleer SAT-monsters onder steriele omstandigheden en behandel de weefselmonsters na verzameling in een laminaire stroomkap onder strikte aseptische omstandigheden om bacteriële besmetting te voorkomen. 2. Isolatie en cultuur van endotheelcellen OPMERKING: Een schema voor hSATMVEC-isolatie wordt weergegeven in figuur 1. Gebruik voor hSATMVEC-isolatie minimaal 250 mg vers onderhuids vetweefsel (SAT) verkregen tijdens CIED-implantatie van SAT dat over de grote borstspier ligt (zie figuur 1).OPMERKING: Het gebruik van grotere hoeveelheden verse SAT verhoogt de opbrengst van hSATMVEC tijdens isolatie en heeft de grootste kans op succesvolle isolatie en hSATMVEC-cultuur. Plaats SAT onmiddellijk in een ijskoude, magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) weefselopslagoplossing in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml voordat u het naar het laboratorium overbrengt.OPMERKING: Voor de grootste kans op succesvolle isolatie moet hSATMVEC-isolatie zo snel mogelijk worden uitgevoerd. SAT kan echter indien nodig tot 24 uur op ijs worden bewaard voordat het wordt geïsoleerd. Bereid als volgt een 1 mg/ml collagenase/dispase-werkoplossing voor.Reconstitueer eerst 500 mg collagenase/dispase gevriesdroogd poeder in 5 ml steriel water om een collagenase/dispase bouillonoplossing te vormen met een concentratie van 100 mg/ml. Verdun voor elke hSATMVEC-isolatie 100 μL collagenase/dispase-bouillonoplossing in 10 ml koude Hanks’ Balanced Salt-oplossing om te eindigen met een werkoplossing van 1 mg/ml. Gebruik in een laminaire stroomkast twee scalpels om weefsels in ~1 mm3 stukken in 500 μL 1 mg/ml collagenase/dispase-oplossing op het deksel van een petrischaaltje te verkleinen, te tritureren en over te brengen in een schone centrifugebuis van 50 ml. Was het deksel van de petrischaal met 4,5 ml verse 1 mg/ml collagenase/dispase-oplossing en voeg toe aan de centrifugebuis van 50 ml. Laat 30 minuten verteren bij 37 °C in een buisrotator bij 20 tpm. Stop het verteringsproces door 10 ml compleet EC groeimedium MV toe te voegen. Trituer het verteerde mengsel en haal het door een zeef van 70 μm. Spoel de zeef af met 10 ml 0,5% fosfaatgebufferde zoutoplossing – runderserumalbumine (PBS-BSA). Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap met nog eens 5 ml 0,5% PBS-BSA. Verwijder vervolgens de dode cellen met behulp van een kit voor het verwijderen van dode cellen. Om dit te doen, incubeert u de celpellet in 200 μl dode celverwijderingskorrels (vortex vóór gebruik) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Bevestig een LS-kolom met een filter van 30 μm aan de separatormagneet en plaats er een centrifugebuis van 15 ml onder. Was de magnetische kolom eenmaal met 1 ml bindingsbuffer voor het verwijderen van dode cellen voordat u het monster/de druppelsuspensie toevoegt en laat deze passief onder de zwaartekracht passeren. Was vervolgens de kolom door 0,5 ml bindingsbuffer toe te voegen en laat deze passief door de kolom gaan. Herhaal deze wasbeurt vier keer. Verzamel het eluaat als een levende celfractie, draai de cellen gedurende 10 minuten op 300 x g bij RT en was en resuspendeer vervolgens de resulterende pellet in 400 μL 0,5% PBS-BSA. Voeg 20 μL anti-CD31 gecoate magnetische kralen toe aan de gesuspendeerde cellen en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C . Centrifugeer het monster na de incubatie gedurende 5 minuten bij RT bij 300 x g en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celkorrel in 500 μl 0,5% PBS-BSA. Bevestig een MS-kolom met een filter van 30 μm aan de separatormagneet en plaats er een centrifugebuis van 15 ml onder. Vul de kolom met 500 μL 0,5% PBS-BSA. Herhaal deze stap twee keer. Voeg de cel-microbead-suspensie toe en laat deze onder de zwaartekracht passeren. Was de kolom drie keer met 500 μL 0,5% PBS-BSA. De doorstroming in de centrifugebuis onder de kolom bevat de CD31-fractie . Om de CD31+- fractie (d.w.z. de fractie die hSATMVEC’s bevat) te verzamelen, verwijdert u de MS-kolom van de separatormagneet en plaatst u deze in een verse centrifugebuis van 15 ml. Voeg 1 ml 0,5% PBS-BSA toe en breng in één vloeiende beweging de kolomzuiger aan om de opgevangen hSATMVEC’s vrij te geven. Centrifugeer het monster bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 1 ml volledig EC-groeimedium MV en verdeel de celoplossing van 1 ml over een of twee putjes (afhankelijk van de korrelgrootte) van een 2% gelatine-gecoate plaat met 24 putjes (Passage 0).OPMERKING: Maak u geen zorgen als er in de eerste paar dagen na isolatie weinig aanhangende cellen zijn. Wissel elke 3 dagen van medium. Kweekcellen bij 37 °C met 5% CO2 . Zodra geïsoleerde cellen ~80% confluentie bereiken (2-4 weken), plaatst u ze op een enkel putje van een plaat met zes putjes (passage 1).OPMERKING: Daaropvolgende passages kunnen cellen opnieuw platen van één confluente donorput naar ontvangende putjes. Experimenten werden uitgevoerd in cellen van passage 2-4 generatie nadat cellen een zuiverheid van >99% hadden aangetoond met behulp van flowcytometrie (zie rubriek 3). Cellen behielden typische endotheelmorfologie tot ten minste passage 5. 3. Flowcytometrie Controleer voorafgaand aan flowcytometrie de hSATMVEC’s visueel om er zeker van te zijn dat ze confluent en morfologisch representatief leken. Voer flowcytometrische beoordeling uit van hSATMVEC’s bij passage 2, met behulp van cellen uit een enkel putje van een plaat met 6 putjes. Was de cellen twee keer met PBS door 500 μL PBS goed toe te voegen en elke keer aan te zuigen. Voeg vervolgens 300 μL/putje warme trypsine/EDTA (0,25%) oplossing toe. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2 min. Eenmaal losgemaakt, neutraliseert u de trypsine/EDTA-oplossing met 700 μl volledig EC-groeimedium MV en brengt u het over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 8 minuten bij RT. Gooi het supernatans weg zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de celpellet in een MACS-buffer van 1 ml en verdeel deze over twee microcentrifugebuisjes van 1,5 ml met het label ongekleurde controle en gekleurd monster (500 μl per putje). Voeg een extra MACS-buffer van 500 μl toe aan elke microcentrifugebuis, voordat u opnieuw centrifugeert op 400 x g gedurende 8 minuten bij RT. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 100 μl MACS-buffer voor ongekleurde controle en 100 μl kleuringscocktail (aanvullende tabel 1) voor het gekleurde monster. Kleuring van de cellen met CD45-FITC (de pan-leukocytenmarker), evenals CD144-PE en CD31-PerCP (die tot expressie worden gebracht door endotheelcellen). Draai de gesuspendeerde cellen kort gedurende 5 s en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C. Voeg vervolgens 1 ml MACS-buffer toe aan elke buis, centrifugeer opnieuw op 400 x g gedurende 8 minuten bij RT en gooi het supernatant weg. Resuspendeer ten slotte de celpellet in 500 μl MACS-buffer en breng deze over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml. Plaats de geëtiketteerde buis in een afgedekte ijsdoos, klaar voor analyse.OPMERKING: Alle opgenomen flowcytometrieanalyses werden uitgevoerd op een Beckman Coulter Cytoflex 4-laser flowcytometersysteem (met alleen de 488 nm excitatielaser). Stel de maximale emissiegolflengte en filter voor elke fluorochome als volgt in: CD45-FITC – emissie maximaal 520 nm, filter 525/50; CD144-PE – emissie maximaal 578 nm, filter 585/40; CD31-PerCP – emissie maximaal 675 nm, filter 655-730. Zoals geïllustreerd in figuur 2, registreert u gegevens voor 10.000 cellen per monster in een singlet-poort (P2). Controleer of P1 een grote celcluster omringt en of de meeste van deze cellen in de P2-singletpoort vallen. Zorg ervoor dat de ongekleurde controle minimale CD45-CD144+CD31+-cellen heeft als % van singlets. Noteer het percentage CD45-CD144+CD31+ celenkelingen in het gekleurde monster. 4. Verdubbelingstijd van endotheelcellen en celproliferatie (figuur 3) Tel bij passages 2 en 3 het aantal levensvatbare hSATMVEC’s voor elk monster met behulp van hemocytometrie. Noteer de datum en tijd van elk celgetal. Bereken het aantal populatieverdubbelingen tussen deze punten volgens de vergelijking: verdubbelingstijd = (duur x log(2))/(log (eindconcentratie)-log(beginconcentratie)).OPMERKING: Een online calculator is beschikbaar op https://doubling-time.com/compute.php. Beoordeel de proliferatie van hSATMVEC’s met behulp van een in de handel verkrijgbare beeldvormingskit voor celproliferatie. Zaad hSATMVEC’s met een dichtheid van 20.000 cellen per putje in een plaat met 24 putjes en laat ze een nacht staan in volledig EC-groeimedium MV om te herstellen. Voeg de volgende dag 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) toe aan elk putje verdund in volledig EC groeimedium MV met een eindconcentratie van 10 μM. Incubeer bij 37 °C (5% CO2) gedurende 2 uur. Verwijder de EdU-bevattende media en was elke put twee keer met PBS. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij RT. Was elk putje twee keer met PBS en voeg 500 μL 0,5% Triton X-100 toe in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) buffer. Laat 20 minuten bij RT incuberen.OPMERKING: Dit permeabiliseert het celmembraan, waardoor Alexa fluor 488-gelabeld azide in de cel kan komen. Bereid de Alexa fluor 488-gelabelde azidecocktail volgens de instructies van de fabrikant, afhankelijk van het aantal putjes (zie6). Was elk putje twee keer met PBS voordat u 100 μL Alexa fluor 488-gelabelde azidecocktail toevoegt en gedurende 30 minuten incubeert bij RT, beschermd tegen licht.OPMERKING: De Alexa fluor 488-gelabelde azidecocktail reageert met de EdU in een klikreactie. Verwijder de azidecocktail met Alexa fluor 488-label en was twee keer met PBS. Voeg 500 μL propidiumjodide per putje toe en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.OPMERKING: Deze stap gaat kernen (zowel prolifererend als niet-prolifererend) rood tegen.Verwijder propidiumjodide, was twee keer met PBS en laat elk putje in 500 μL PBS voor beeldvorming. Maak een beeld van elke put in 4 krachtige velden met een vergroting van 10x, met 495/519 nm excitatie/emissie voor het 488 nm azide (zie figuur 3C).OPMERKING: De beelden in de afbeeldingen zijn vastgelegd met behulp van een live-celanalysesysteem met een vergroting van 10x en een belichtingstijd van 800 ms. Tel het aantal prolifererende cellen (groen) en druk uit als een percentage (%) van het totale aantal cellen binnen elk veld met een hoog vermogen (gemiddeld 4 regio’s per put). 5. Vorming van endotheelcellen Laat Matrigel (basaalmembraanmatrix; BMM) om een nacht op ijs te ontdooien. Voeg de volgende dag, met de plaat op ijs, indien nodig 160 μL BMM toe aan elk putje van een plaat met 24 putjes. Kantel de plaat om volledige dekking van elk putje met BMM te krijgen. Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 om op te stijven tijdens de bereiding van de cellen. Zaad hSATMVECs in 100.000 cellen (in 1 ml media) per putje. Pipeteer aan de zijkant van het putje en zorg ervoor dat u langzaam pipet om te voorkomen dat de matrix losraakt. Incubeer de plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 4 uur.OPMERKING: Op dit punt is de plaat klaar om te worden afgebeeld. De resultaten en figuren hieronder zijn de fasebeeldvorming op het live-cell analysesysteem bij 10x vergroting werd gebruikt in 5 verschillende putgebieden (zie figuur 3D). Tel het aantal hele buizen in elk veld met hoog vermogen en bereken een gemiddelde waarde voor elk monster. 6. Insulinestimulatie van hSATMVEC Kweek hSATMVEC op een plaat met 6 putjes bij 37 °C met 5% CO2 . Eenmaal confluent, verwijdert u het volledige groeimedium MV van de endotheelcellen en wast u het tweemaal met PBS. Voeg 500 μl serumuithongeringsmedia (endotheelcelgroeimedia MV zonder supplementen) toe aan elk putje en laat gedurende 4 uur incuberen bij 37 °C met 5% CO2 . Bereid gedurende deze tijd aliquots van 500 μL met toenemende insulineconcentraties (0-150 μM) bereid in serumuithongeringsmedia. Nadat het serum gedurende 4 uur is uitgehongerd, verwijdert u de media uit de putjes, voegt u 1 ml insulinebevattende media (met toenemende concentraties) toe aan elk putje en incubeert u gedurende 10 minuten bij 37 °C met 5% CO2. Was twee keer met koude PBS voordat u 100 μL eiwitlysisbuffer met protease en fosfataseremmers toevoegt om cellen te lyseren voor eiwit. Kwantificeer het eiwit met behulp van de BCA-test.OPMERKING: In het hieronder beschreven experiment werden cellysaten gedurende 30 minuten in een ijsbad geïncubeerd en gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 20.000 x g . Voorafgaand aan de elektroforese werden eiwitmonsters gekookt om de eiwitten gedurende 5 minuten bij 95 °C te denatureren. Eiwitten werden opgelost op een NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan. Immunoblotanalyse werd uitgevoerd volgens standaardprotocollen met behulp van relevante fosfoproteïne-antilichamen en totale eiwitantilichamen (volgens de instructies van de fabrikant). Een geschikt secundair Ig/HRP-antilichaam werd gebruikt om het primaire antilichaam te detecteren (volgens de instructies van de fabrikant). Eiwitniveaus werden gekwantificeerd met behulp van densitometrie op basis van de intensiteit van de banden van elk monster. Waar nodig werd ß-actine gebruikt als ladingscontrole. 7. Opzetten van hSATMVEC-adipocyten co-cultuur (Figuur 4) OPMERKING: In de onderstaande resultaten werden in de handel verkrijgbare menselijke witte subcutane pre-adipocyten bij passage 2 van een enkele mannelijke blanke donor gebruikt in alle adipocytentesten. Preadipocyten werden aanvankelijk geëxpandeerd van de door de leverancier geleverde injectieflacon (passage 0) tot twaalf cryoflacons met cryo-SFM-vriesmedia (passage 1). Elke co-cultuurplaat met 24 putjes vereist één cryovial van pre-adipocyten (passage 1). Ontdooi elke injectieflacon en plaat snel in een T75-kolf met 12-15 ml warme PGM-2-media (met 10% FBS, 30 μg/ml L-glutamine en 15 ng/ml GA-1000 SingleQuots). Wissel elke 3 dagen van media tot 90% samenvloeit. Zodra 90% samenvloeit, wast u de menselijke witte onderhuidse preadipocyten met PBS en voegt u vervolgens 1 ml trypsine/EDTA-oplossing toe (0,25%). Laat 2 minuten op RT staan en bevestig de onthechting met lichtmicroscopie. Voeg 23 ml PGM-2-media toe om de trypsine/EDTA te neutraliseren en maak een preadipocyt-gesuspendeerde oplossing van 24 ml. Doe 1 ml gesuspendeerde menselijke subcutane witte preadipocytenoplossing in elk putje van een 24-well co-cultuur begeleidende plaat en groei tot samenvloeiing (meestal 2-3 dagen). Bereid tijdens het groeien naar samenvloeiing preadipocytendifferentiatiemedia (PDM) voor. Om PDM te bereiden, maakt u een 2x PDM-voorraad door een gepatenteerde mix van insuline, dexamethason, indomethacine en isobutyl-methylxanthine toe te voegen aan PGM-basismedia. Verdun 2x PDM in een verhouding van 1:1 met PGM om 1x PDM te maken. Eenmaal samenvloeiend, differentieer de menselijke onderhuidse witte preadipocyten door media te veranderen in 1 ml van 1x PDM-media in elk putje (dag 0). Laat de menselijke onderhuidse witte pre-adipocyten gedurende 10 dagen (zonder mediaveranderingen) bij 37 °C 5% CO2 incuberen om volledig te differentiëren. Bewaak de differentiatie met behulp van lichtfasemicroscopie (zie figuur 4B).OPMERKING: Gedifferentieerde adipocyten kunnen niet worden gepasseerd en kunnen worden gebruikt voor tests van dag 10 tot dag 12. Differentiatie van adipocyten kan worden gemeten door mRNA-amplificatie van leptine, adiponectine en PPAR-γ. Op dag 6 van de differentiatie wordt hSATMVECs zaad met een dichtheid van 5 x 104 cellen per insert in 500 μL voltooid EC-groeimedium MV op transwell-inserts (0,4 μM-membraan). Plaats de transwell-inzetstukken in een putje met 500 μl compleet EC-groeimedium MV () en groei tot samenvloeiing bij 37 °C in 5% CO2. Op dag 10, wanneer de adipocyten volledig zijn gedifferentieerd, verwijdert u de helft van de PDM-media uit elk putje en brengt u de transwell-inserts met confluent hSATMVEC in hun eigen media (ECGM-MV) over naar elk putje (zie figuur 4A). Laat de cellen 24 uur in cocultuur voordat u de transwell-inserts verwijdert en voer tests uit om de functie van adipocyten te beoordelen.OPMERKING: Op dit tijdstip kunnen adipocyten indien nodig ook worden gelyseerd voor eiwit- of RNA-isolatie. 8. Opname van adipocyten 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-deoxyglucose (2-NBD)-glucose Verwijder na 24 uur in cocultuur de celinserts die hSATMVEC bevatten. Voeg vervolgens 2-NBD-glucose toe aan de media in elk putje om een uiteindelijke concentratie van 20 μM te bereiken. Beschermen tegen licht en 30 minuten incuberen bij 37 °C met 5% CO2. Was de cellen twee keer in PBS en fixeer de adipocyten met 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten bij RT. Was de cellen drie keer in PBS voordat ze vertrekken in 100 μL PBS.OPMERKING: Op dit punt zijn de adipocyten klaar om te worden afgebeeld. In de bijgevoegde figuren werden fasebeeldvorming en groen licht (excitatie 440-480 nm/emissie 504-544 nm) verkregen op het live-celanalysesysteem bij een vergroting van 10x in vier krachtige velden (zie figuur 4C). Kwantificeer het niveau van glucoseopname door het percentage groen van het totale gebied te kwantificeren met behulp van drempelwaarden in ImageJ (of een ander vergelijkbaar softwarepakket).