ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

記載されている技術で使用されるヒト組織のサンプルは、Leeds Teaching Hospitals NHS Trust(英国リーズ)の日常的な臨床診療に従って、ガイドラインで示されたCIEDの挿入を受けている患者から採取されています。研究プロトコルは、他のすべての文書とともに、参加者の登録前に地元の倫理委員会(11/YH/0291)によって承認されました。この研究は、ヘルシンキ宣言の原則に準拠して実施されました。 1. 患者集団 CIED 移植中に、大胸筋を覆う SAT から新鮮な皮下脂肪組織 (SAT) を取得します。 SATサンプルを無菌条件下で分離し、細菌汚染を防ぐために、厳格な無菌条件下で層流フードで収集した後、組織サンプルを処理します。 2. 内皮細胞の単離と培養 注:hSATMVECアイソレーションの概略図を 図1に示します。 hSATMVECの単離には、大胸筋を覆うSATからのCIED移植中に得られた新鮮な皮下脂肪組織(SAT)を最低250mg使用します( 図1を参照)。注:新鮮なSATを大量に使用すると、単離中のhSATMVECの収量が増加し、単離とhSATMVEC培養が成功する可能性が最も高くなります。 直ちにSATを1.5 mLの微量遠心チューブ内の氷冷磁気活性化セルソーティング(MACS)組織保存溶液に入れてから、ラボに移します。注:分離が成功する可能性を最大限に高めるには、hSATMVEC分離をできるだけ早く実行する必要があります。ただし、SATは、必要に応じて分離する前に氷上に最大24時間保存できます。 1 mg/mLのコラゲナーゼ/ディスパーゼワーキング溶液を以下のように調製します。まず、500 mgのコラゲナーゼ/ディスパーゼ凍結乾燥粉末を5 mLの滅菌水に再構成して、100 mg/mLの濃度のコラゲナーゼ/ディスパーゼストック溶液を形成します。 hSATMVEC単離ごとに、100 μLのコラゲナーゼ/ディスパーゼストック溶液を10 mLの冷たいHanks’Balanced Salt溶液に希釈して、1 mg/mLの作業溶液にします。 層流キャビネットで、2つのメスを使用して、ペトリ皿の蓋に500 μLの1 mg/mLコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液で組織を~1mm3 個刻み、粉砕して清潔な50 mL遠心チューブに移します。 シャーレの蓋を4.5 mLの新鮮な1 mg / mLコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液で洗い、50 mLの遠心チューブに加えます。.20 rpmのチューブローテーターで37°Cで30分間消化します。10 mLの完全EC増殖培地MVを添加して、消化プロセスを停止します。 消化した混合物を粉砕し、70 μmのセルシーブに通します。10mLの0.5%リン酸緩衝生理食塩水-ウシ血清アルブミン(PBS-BSA)緩衝液でふるいをすすぎます。サンプルを300 x g で室温で10分間遠心分離し、上清を捨てます。このステップを、さらに5 mLの0.5% PBS-BSAで繰り返します。 次に、死細胞除去キットを使用して死細胞を除去します。これを行うには、細胞ペレットを200 μLの死細胞除去ビーズ(使用前のボルテックス)で、1.5 mLの微量遠心チューブ内で室温(RT)で15分間インキュベートします。 30 μmフィルター付きLSカラムをセパレーターマグネットに取り付け、その下に15 mLの遠心チューブを置きます。マグネティックカラムを1 mLの死細胞除去結合バッファーで1 mL洗浄してから、サンプル/ビーズ懸濁液を添加し、重力下で受動的に通過させます。 次に、0.5 mLの結合バッファーを加えてカラムを洗浄し、受動的にカラムを通過させます。この洗浄を4回繰り返します。 溶出液を生細胞画分として回収し、細胞を 300 x g で RT で 10 分間遠心した後、得られたペレットを 0.5% PBS-BSA の 400 μL で洗浄して再懸濁します。 20 μLの抗CD31コーティング磁気ビーズを懸濁細胞に加え、4°Cで20分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットを0.5% PBS-BSAの500 μLに再懸濁します。 30 μmフィルター付きのMSカラムをセパレーターマグネットに取り付け、その下に15 mLの遠心チューブを置きます。カラムを 500 μL の 0.5% PBS-BSA でプライミングします。この手順を 2 回繰り返します。 細胞マイクロビーズ懸濁液を添加し、重力下で通過させます。カラムを 500 μL の 0.5% PBS-BSA で 3 回洗浄します。カラムの下の遠心分離管内のフロースルーには、CD31- 画分が含まれています。 CD31+ フラクション(hSATMVECsを含むフラクション)を回収するには、MSカラムをセパレーターマグネットから取り外し、新しい15 mL遠心チューブに入れます。0.5% PBS-BSA 1 mL を添加し、カラムプランジャーを 1 回の滑らかな操作で塗布して、捕捉した hSATMVEC を放出します。 サンプルを300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットを1 mLの完全EC増殖培地MVに再懸濁し、1 mLの細胞溶液を2%ゼラチンコーティングされた24ウェルプレート(Passage 0)の1つまたは2つのウェル(ペレットサイズによる)に分割します。注:単離後の最初の数日間に付着細胞がほとんどなくても心配しないでください。 メディアは3日ごとに交換します。細胞を37°Cで5%CO2で培養します。単離された細胞が~80%のコンフルエント度(2〜4週間)に達したら、それらを6ウェルプレートの1つのウェルに継代します(継代1)。注:その後の継代では、1つのコンフルエントドナーウェルからレシピエントウェルに細胞を再播種することができます。実験は、フローサイトメトリーを使用して細胞が>99%の純度を示した後、継代2〜4世代の細胞で行った(セクション3を参照)。細胞は、少なくとも継代5まで典型的な内皮形態を維持した。 3. フローサイトメトリー フローサイトメトリーの前に、hSATMVECを目視で確認し、それらがコンフルエントで形態学的に代表的であることを確認します。6ウェルプレートの1ウェルの細胞を用いて、継代2におけるhSATMVECのフローサイトメトリー評価を行います。 PBSで細胞を2回洗浄し、500μLのPBSをウェルに加え、毎回吸引します。次に、300 μL/ウェルの温かいトリプシン/EDTA(0.25%)溶液を加えます。37°Cで5% CO2 と2分間インキュベートします。 取り外したら、トリプシン/EDTA溶液を700 μLの完全EC増殖培地MVで中和し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。 細胞懸濁液を400 x g でRTで8分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を廃棄します。次に、細胞ペレットを1 mL MACSバッファーに再懸濁し、未染色コントロールと染色サンプル(ウェルあたり500 μL)を標識した2本の1.5 mL微量遠心チューブに分けます。 各微量遠心チューブに500 μLのMACSバッファーを追加した後、再度400 x g でRTで8分間遠心分離します。 上清を捨て、未染色のコントロール用に100 μLのMACSバッファーに細胞ペレットを再懸濁し、染色したサンプル用に100 μLの染色カクテル(補足表1)に再懸濁します。CD45-FITC(汎白血球マーカー)、CD144-PEおよびCD31-PerCP(内皮細胞によって発現される)で細胞を染色します。 懸濁細胞を5秒間短時間ボルテックスし、次いで4°Cで10分間インキュベートします。次に、各チューブに1 mLのMACSバッファーを加え、再度400 x g でRTで8分間遠心分離し、上清を捨てます。 最後に、細胞ペレットを500 μLのMACSバッファーに再懸濁し、新鮮な1.5 mLの微量遠心チューブに移します。ラベル付きのチューブを蓋付きのアイスボックスに入れ、分析の準備が整います。注:含まれているすべてのフローサイトメトリー分析は、Beckman Coulter Cytoflex 4レーザーフローサイトメーターシステム(488 nm励起レーザーのみを使用)で実施しました。 各フルオロチョメの最大発光波長とフィルターを次のように設定します:CD45-FITC-最大発光520 nm、フィルター525/50;CD144-PE – 最大発光578 nm、フィルター585/40;CD31-PerCP – 最大蛍光675 nm、フィルター655-730。 図2に示すように、サンプルあたり10,000個の細胞のデータを一重項ゲート(P2)に記録します。P1 が主要なセル クラスターを囲んでいること、およびこれらのセルのほとんどが P2 一重項ゲートにあることを確認します。未染色のコントロールが、一重項の割合としてCD45-CD144+CD31+細胞が最小限であることを確認してください。 染色したサンプル中のCD45-CD144+CD31+細胞シングレットの割合を記録します。 4. 内皮細胞の倍加時間と細胞増殖(図3) 継代2と3で、血球計算盤を使用して各サンプルの生存可能なhSATMVECの数を数えます。各セルカウントの日時を記録します。 これらの点間の母集団の倍増の数を、倍増時間 = (持続時間 x log(2))/(log (最終濃度)-log(初期濃度))の式に従って計算します。注:オンライン計算機は https://doubling-time.com/compute.php で入手できます。 市販の細胞増殖イメージングキットを使用して、hSATMVECの増殖を評価します。24ウェルプレートにウェルあたり20,000細胞の密度でhSATMVECを播種し、完全なEC増殖培地MVに一晩放置して回収します。 翌日、最終濃度10 μMの完全EC増殖培地MVで希釈した各ウェルに5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)を加え、37°C(5%CO2)で2時間インキュベートします。 EdU含有メディアを取り出し、各ウェルをPBSで2回洗浄します。細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定し、各ウェルをPBSで2回洗浄し、0.5% Triton X-100をトリス緩衝生理食塩水(TBS)緩衝液(TBS)バッファーに500μL加えます。室温で20分間インキュベートします。注:これにより細胞膜が透過し、Alexa Fluor 488標識アジドが細胞に侵入できるようになります。 Alexa fluor 488ラベル付きアジドカクテルは、ウェル数に応じて、製造元の指示に従って準備します(6を参照)。各ウェルをPBSで2回洗浄した後、100 μLのAlexa fluor 488標識アジドカクテルを加え、光から保護されたRTで30分間インキュベートします。注:Alexa fluor 488で標識されたアジドカクテルは、クリック反応でEdUと反応します。 Alexa fluor 488ラベル付きアジドカクテルを取り出し、PBSで2回洗います。ウェルあたり500 μLのヨウ化プロピジウムを添加し、室温で20分間インキュベートします。注:このステップでは、核(増殖性および非増殖性の両方)を赤く対比染色します。ヨウ化プロピジウムを除去し、PBSで2回洗浄し、各ウェルを500 μLのPBSに残してイメージングします。 488 nmのアジドに対して495/519 nmの励起/発光で、10倍の倍率で4つの高倍率フィールドの各ウェルをイメージングします( 図3Cを参照)。注:図中の画像は、生細胞解析システムを使用して、倍率10倍、露光時間800msで撮影されました。 増殖細胞の数をカウントし(緑)、各高出力フィールド内の全細胞の割合(%)で表します(ウェルあたり平均4領域)。 5. 内皮細胞管形成 マトリゲル(基底膜マトリックス;BMM)を氷の上で一晩解凍します。翌日、プレートを氷上に置き、必要に応じて24ウェルプレートの各ウェルに160 μLのBMMを加えます。プレートを傾けて、BMMで各ウェルを完全にカバーします。プレートを5% CO2 を入れた37°Cのインキュベーターに置き、細胞を調製しながらセットします。 hSATMVECをウェルあたり100,000細胞(培地1mL中)で播種します。ウェルの側面でピペットを動かし、マトリックスが外れないようにゆっくりとピペットするように注意してください。プレートを5%CO2 とともに37°Cで4時間インキュベートします。注意: この時点で、プレートを画像化する準備が整いました。10倍の倍率で生細胞解析システム上での位相イメージングの結果と図は、5つの異なるウェル領域で使用されました( 図3Dを参照)。 各高出力フィールド内のチューブ全体の数をカウントし、各サンプルの平均値を計算します。 6. hSATMVECのインスリン刺激 hSATMVECを6ウェルプレートで37°C、5%CO2で培養します。コンフルエントになったら、完全な内皮細胞増殖培地MVを取り出し、PBSで2回洗浄します。 500 μLの血清飢餓培地(サプリメントを含まない内皮細胞増殖培地MV)を各ウェルに加え、5% CO2 を用いて37°Cで4時間インキュベートします。この間に、血清飢餓培地で調製したインスリン濃度の増加(0〜150μM)の500μLアリコートを調製します。. 血清を4時間飢餓状態にした後、ウェルから培地を取り出し、各ウェルに1 mLのインスリン含有培地(濃度が増す)を加え、5% CO2で37°Cで10分間インキュベートします。 冷たいPBSで2回洗浄した後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むタンパク質溶解バッファー100 μLを細胞のタンパク質溶解に添加します。BCAアッセイを用いてタンパク質を定量します。注:以下で説明する実験では、細胞溶解物を氷浴中で30分間インキュベートし、20,000 x g で15分間遠心分離しました。電気泳動に先立ち、タンパク質サンプルを煮沸して、タンパク質を95°Cで5分間変性させました。タンパク質をNuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelで分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写しました。イムノブロット分析は、関連するリン酸化タンパク質抗体および総タンパク質抗体(製造元の指示に従って)を使用して、標準プロトコルに従って実施しました。適切なIg/HRP二次抗体を使用して一次抗体を検出しました(製造元の指示に従って)。タンパク質のレベルは、各サンプルのバンドの強度に基づくデンシトメトリーを使用して定量化しました。ß-アクチンは、適切な場合、ローディング制御として使用されました。 7. hSATMVEC-脂肪細胞共培養のセットアップ(図4) 注:以下の結果では、単一の男性白人ドナーからの継代2で市販のヒト白色皮下前脂肪細胞をすべての脂肪細胞アッセイで使用しました。プレアプリアドポサイトは、最初にベンダー提供のバイアル(継代0)から、クライオSFM凍結培地を含む12のクライオバイアル(継代1)に増殖しました。 各24ウェル共培養プレートには、前駆脂肪細胞のクライオバイアルが1つ必要です(継代1)。各バイアルとプレートを、12〜15 mLの温かいPGM-2培地(10% FBS、30 μg/mL L-グルタミン、および15 ng/mL GA-1000 SingleQuotsを含む)を含むT75フラスコに急速に解凍します。90%がコンフルエントになるまで、3日ごとにメディアを交換します。 90%がコンフルエントになったら、ヒトの白い皮下前脂肪細胞をPBSで洗浄し、1 mLのトリプシン/ EDTA溶液(0.25%)を追加します。.室温で2分間放置し、光学顕微鏡で剥離を確認します。23 mLのPGM-2培地を添加してトリプシン/EDTAを中和し、24 mLのプレアプリアドポサイト懸濁溶液を調製します。 1 mLの懸濁したヒト皮下白色プレアプリアドサイト溶液を24ウェル共培養コンパニオンプレートの各ウェルに入れ、コンフルエント(通常2〜3日)まで成長させます。 コンフルエントまで成長しながら、前脂肪細胞分化培地(PDM)を調製します。PDMを調製するには、インスリン、デキサメタゾン、インドメタシン、およびイソブチル-メチルキサンチンの独自の混合物をPGMベース培地に添加して、2倍のPDMストックを作成します。2x PDMをPGMで1:1の比率で希釈して、1x PDMを作成します。 コンフルエントになったら、培地を各ウェルに1 mLの1x PDM培地に変更することにより、ヒト皮下白色前駆脂肪細胞を分化します(0日目)。ヒト皮下白色前駆細胞を37°C、5%CO2 で10日間(培地交換なし)、完全に分化させるため、放置します。光相顕微鏡を使用して分化をモニターします( 図4Bを参照)。注:分化した脂肪細胞は継代できず、10日目から12日目までのアッセイに使用できます。脂肪細胞の分化は、レプチン、アディポネクチン、およびPPAR-γのmRNA増幅によって測定できます。 分化の6日目に、トランズウェルインサート(0.4 μMメンブレン)上の500 μL完全EC増殖培地MVに、インサートあたり5 x 104 細胞の密度でhSATMVECを播種します。トランズウェルインサートを500 μLの完全EC増殖培地MV()を含むウェルに入れ、5% CO 2で37°Cでコンフルエンスまで増殖します。 10日目に、脂肪細胞が完全に分化したら、各ウェルからPDM培地の半分を取り出し、自身の培地(ECGM-MV)にコンフルエントhSATMVECを含むトランズウェルインサートを各ウェルに移します( 図4Aを参照)。 細胞を24時間共培養した後、トランズウェルインサートを取り出し、脂肪細胞の機能を評価するアッセイを実施します。注:この時点で、脂肪細胞は、必要に応じてタンパク質またはRNAの分離のために溶解することもできます。 8.脂肪細胞2-(N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ)-2-デオキシグルコース(2-NBD)-グルコースの取り込み 共培養で24時間後、hSATMVECを含む細胞インサートを取り出します。次に、各ウェルの培地に2-NBD-グルコースを添加して、最終濃度を20 μMにします。光から保護し、5% CO2で37°Cで30分間インキュベートします。 PBSで細胞を2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500μLを使用して脂肪細胞を室温で15分間固定します。注:この時点で、脂肪細胞を画像化する準備が整いました。含まれている図では、位相イメージングと緑色光(励起440-480 nm/発光504-544 nm)が、4つの高倍率フィールド( 図4Cを参照)で10倍の倍率で生細胞解析システムで得られました。 ImageJ (または他の同様のソフトウェアパッケージ) のしきい値を使用して、全領域の緑の割合を定量化することにより、グルコース取り込みのレベルを定量化します。