Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana
Summary
Burada, Arabidopsis thaliana’da bakteri istilasına karşı stoma yanıtlarının doğrudan gözlemlenmesi ve otomatik ölçümü için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntüleri için tasarlanmış bir görüntü analizi boru hattı ile birlikte taşınabilir bir stoma görüntüleme cihazından yararlanır.
Abstract
Stomalar, bitki yaprağı epidermisinde bulunan mikroskobik gözeneklerdir. Stoma açıklığının düzenlenmesi sadece fotosentez ve transpirasyonel su kaybı için karbondioksit alımını dengelemek için değil, aynı zamanda bakteri istilasını kısıtlamak için de çok önemlidir. Bitkiler mikropların tanınması üzerine stomaları kapatırken, Pseudomonas syringae pv gibi patojenik bakteriler. domates DC3000 (Pto), yaprağın iç kısmına erişmek için kapalı stomaları yeniden açın. Bakteri istilasına stoma tepkilerini değerlendirmek için yapılan geleneksel tahlillerde, yaprak epidermal kabukları, yaprak diskleri veya müstakil yapraklar bakteri süspansiyonu üzerinde yüzdürülür ve daha sonra stomalar mikroskop altında gözlemlenir ve ardından stoma açıklığının manuel ölçümü yapılır. Bununla birlikte, bu tahliller zahmetlidir ve bitkiye bağlı bir yaprakta doğal bakteri istilasına stoma tepkilerini yansıtmayabilir. Son zamanlarda, bir yaprağı bitkiden ayırmadan sıkıştırarak stomaları gözlemleyebilen taşınabilir bir görüntüleme cihazı ve cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntülerinden stoma açıklığını otomatik olarak ölçmek için tasarlanmış derin öğrenme tabanlı bir görüntü analizi boru hattı geliştirildi. Burada, bu teknik ilerlemelere dayanarak, Arabidopsis thaliana’da bakteri istilasına stoma yanıtlarını değerlendirmek için yeni bir yöntem tanıtıldı. Bu yöntem üç basit adımdan oluşur: doğal enfeksiyon süreçlerini taklit eden Pto’nun sprey aşılanması, taşınabilir görüntüleme cihazı kullanılarak Pto aşılanmış bitkinin bir yaprağındaki stomaların doğrudan gözlemlenmesi ve görüntü analizi boru hattı ile stoma açıklığının otomatik ölçümü. Bu yöntem, doğal bitki-bakteri etkileşimini yakından taklit eden koşullar altında Pto istilası sırasında stoma kapanmasını ve yeniden açılmasını göstermek için başarıyla kullanılmıştır.
Introduction
Stomalar, yaprakların yüzeyinde ve bitkilerin diğer hava kısımlarında bir çift koruyucu hücre ile çevrili mikroskobik gözeneklerdir. Sürekli değişen ortamlarda, stoma açıklığının düzenlenmesi, bitkilerin terleme yoluyla su kaybı pahasına fotosentez için gerekli olan karbondioksit alımını kontrol etmeleri için çok önemlidir. Bu nedenle, stoma açıklığının nicelleştirilmesi, bitki çevresel adaptasyonunu anlamada etkili olmuştur. Bununla birlikte, stoma açıklığının ölçülmesi, mikroskopla yakalanan bir yaprak görüntüsündeki stoma gözeneklerini tespit etmek ve ölçmek için insan emeği gerektirdiğinden, doğası gereği zaman alıcı ve zahmetlidir. Bu sınırlamaları aşmak için, stoma biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model bitki olan Arabidopsis thaliana’da stoma açıklığının ölçülmesini kolaylaştırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir 1,2,3,4,5,6. Örneğin, stoma iletkenliğinin bir ölçüsü olarak terleme hızını ölçmek için bir porometre kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, stoma iletkenliğini belirleyen stoma sayısı ve açıklığı hakkında doğrudan bilgi sağlamaz. Bazı çalışmalar, bir floresan aktin işaretleyicisi, bir floresan boya veya hücre duvarı otofloresansı 1,2,3,4,5 kullanarak stoma gözeneklerini vurgulayan konfokal mikroskopi tekniklerini kullanmıştır. Bu yaklaşımlar stomaların tespitini kolaylaştırırken, hem konfokal mikroskopi tesisi işletme hem de mikroskopi örnekleri hazırlama maliyeti rutin uygulamaya engel olabilir. Sai ve arkadaşları tarafından yapılan çığır açan bir çalışmada, A. thaliana epidermal peelinglerinin parlak alan mikroskobik görüntülerinden stoma açıklığını otomatik olarak ölçmek için derin bir sinir ağı modeli geliştirilmiştir6. Yine de bu yenilik, araştırmacıları mikroskobik gözlem için epidermal bir peeling hazırlama görevinden muaf tutmaz. Son zamanlarda, A. thaliana’nın bir yaprağını sıkıştırarak stomaları gözlemleyebilen taşınabilir bir görüntüleme cihazı ve cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntülerinden stoma açıklığını otomatik olarak ölçen derin öğrenme tabanlı bir görüntü analizi boru hattı geliştirilerek bu engel aşıldı7.
Stomalar, bakteriyel patojenlere karşı bitkinin doğuştan gelen bağışıklığına katkıda bulunur. Bu bağışıklık tepkisinin anahtarı, bakteriyel patojenlerin çoğaldığı ve hastalıklara neden olduğu mikroskobik gözeneklerden yaprak iç kısmına bakteri girişini kısıtlayan stoma kapanmasıdır8. Stoma kapanması, genellikle bir mikrop sınıfında ortak olan immünojenik moleküller olan mikropla ilişkili moleküler paternlerin (MAMP’ler), plazma membran lokalize patern tanıma reseptörleri (PRR’ler) tarafından tanınması üzerine indüklenir9. FLG22 olarak bilinen bakteriyel flagellinin 22 amino asitlik epitopu, PRR FLS210 tarafından tanınması yoluyla stoma kapanmasını indükleyen tipik bir MAMP’dir. Karşı önlem olarak, Pseudomonas syringae pv gibi bakteriyel patojenler. domates DC3000 (Pto) ve Xanthomonas campestris pv. Vezikatoria, stomaları yeniden açmak için virülans mekanizmaları geliştirmiştir 9,11,12. Bakteriyel patojenlere karşı bu stoma tepkileri, geleneksel olarak, yaprak epidermal kabuklarının, yaprak disklerinin veya ayrılmış yaprakların bakteriyel süspansiyon üzerinde yüzdürüldüğü ve daha sonra stomaların mikroskop altında gözlemlendiği ve ardından stoma açıklığının manuel olarak ölçüldüğü deneylerde analiz edilmiştir. Bununla birlikte, bu tahliller zahmetlidir ve bitkiye bağlı bir yaprakta meydana gelen doğal bakteri istilasına karşı stoma tepkilerini yansıtmayabilir.
Burada, doğal bitki-bakteri etkileşimini yakından taklit eden koşullar altında Pto invazyonu sırasında stoma kapanmasını ve yeniden açılmasını araştırmak için basit bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, stoma açıklığının otomatik ölçümü için görüntü analiz boru hattı ile birlikte Pto ile aşılanmış bitkiye bağlı bir yaprak üzerinde A. thaliana stomalarının doğrudan gözlemlenmesi için taşınabilir görüntüleme cihazından yararlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki çalışmalar, bakteri istilalarınastoma tepkilerini araştırmak için epidermal kabuklar, yaprak diskleri veya müstakil yapraklar kullandı 9,11,12. Buna karşılık, bu çalışmada önerilen yöntem, Pto’nun sprey aşılanmasından sonra bitkiye bağlı bir yaprak üzerindeki stomaları doğrudan gözlemlemek için taşınabilir stoma görüntüleme cihazından yararlanır ve bakteri istilasının doğal k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Verimli tartışmalar için ‘Bitki-mikrop holobiontunun montajı yoluyla bitki adaptif özelliklerinin birlikte yaratılması’ araştırma projesinin tüm üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Dönüştürücü Araştırma Alanları için Yardım Hibesi (21H05151 ve 21H05149’dan A.M.’ye ve 21H05152’den YT’ye) ve Zorlu Keşif Araştırmaları için Yardım Hibesi (22K19178’den A.M.’ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
| Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
| Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
References
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291 (2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576 (2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
