תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב – Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.
Abstract
סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המצויות באפידרמיס עלי הצמח. ויסות הצמצם הסטומטלי חיוני לא רק לאיזון ספיגת פחמן דו-חמצני לצורך פוטוסינתזה ואיבוד מים טרנספירטיביים, אלא גם להגבלת פלישת חיידקים. בעוד שצמחים סוגרים פיוניות עם זיהוי חיידקים, חיידקים פתוגניים, כגון מזרקי Pseudomonas pv . עגבניה DC3000 (Pto), פתח מחדש את הפיוניות הסגורות כדי לקבל גישה לפנים העלה. בבדיקות קונבנציונליות להערכת תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים, קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישה חיידקית טבעית בעלה המחובר לצמח. לאחרונה פותח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה מבלי לנתק אותו מהצמח, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה שנועד למדוד באופן אוטומטי את הצמצם הסטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר. כאן, בהתבסס על התקדמות טכנית זו, שיטה חדשה להערכת תגובות stomatal לפלישת חיידקים Arabidopsis thaliana מוצג. שיטה זו מורכבת משלושה שלבים פשוטים: חיסון ריסוס של Pto המחקה תהליכי זיהום טבעיים, תצפית ישירה של פיוניות על עלה של צמח מחוסן Pto באמצעות מכשיר הדמיה נייד, ומדידה אוטומטית של צמצם stomatal על ידי צינור ניתוח תמונה. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי להדגים סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto בתנאים המחקים באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים.
Introduction
סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המוקפות בזוג תאי שמירה על פני השטח של עלים וחלקים אוויריים אחרים של צמחים. בסביבות המשתנות ללא הרף, ויסות הצמצם הסטומטלי הוא מרכזי עבור צמחים כדי לשלוט בספיגת הפחמן הדו-חמצני הנדרשת לפוטוסינתזה על חשבון איבוד מים באמצעות טרנספירציה. לפיכך, כימות הצמצם הסטומטלי סייע להבנת ההסתגלות הסביבתית של הצמח. עם זאת, כימות הצמצם הסטומטלי הוא מטבעו זמן רב ומסורבל מכיוון שהוא דורש עבודה אנושית כדי לזהות ולמדוד נקבוביות סטומטליות בתמונת עלה שצולמה במיקרוסקופ. כדי לעקוף מגבלות אלה, פותחו שיטות שונות כדי להקל על כימות הצמצם הסטומטלי ב- Arabidopsis thaliana, צמח מודל המשמש באופן נרחב לחקר ביולוגיה סטומטית 1,2,3,4,5,6. לדוגמה, ניתן להשתמש בפורומטר כדי למדוד את קצב השעתוק כמדד של מוליכות סטומטלית. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת מידע ישיר על מספר הסטומטלית והצמצם הקובעים את המוליכות הסטומטלית. מחקרים מסוימים השתמשו בטכניקות מיקרוסקופיה קונפוקלית המדגישות נקבוביות סטומאטליות באמצעות סמן אקטין פלואורסצנטי, צבע פלואורסצנטי או אוטופלואורסצנטיות של דופן התא 1,2,3,4,5. בעוד שגישות אלה מקלות על איתור פיוניות, העלות הן של הפעלת מתקן מיקרוסקופיה קונפוקלית והן של הכנת דגימות מיקרוסקופיה יכולה להוות מכשול ליישום שגרתי. בעבודה פורצת דרך של סאי ואחרים, פותח מודל רשת עצבית עמוקה למדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי מתמונות מיקרוסקופיות בשדה בהיר של קליפות אפידרמיס A. thaliana 6. עם זאת, חידוש זה אינו פוטר חוקרים מהמשימה של הכנת קליפת אפידרמיס לתצפית מיקרוסקופית. לאחרונה, התגברו על מכשול זה על ידי פיתוח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה של A. thaliana, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה המודד באופן אוטומטי צמצם סטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר7.
סטומטות תורמות לחסינות מולדת של הצמח מפני פתוגנים חיידקיים. המפתח לתגובה חיסונית זו הוא סגירה סטומטית המגבילה את כניסת החיידקים דרך הנקבובית המיקרוסקופית אל פנים העלה, שם פתוגנים חיידקיים מתרבים וגורמים למחלות8. סגירה סטומטית נגרמת על ידי זיהוי של דפוסים מולקולריים הקשורים למיקרובים (MAMPs), מולקולות אימונוגניות המשותפות לעתים קרובות לסוג של מיקרובים, על ידי קולטני זיהוי תבניות מקומיות של קרום פלזמה (PRR)9. אפיטופ של 22 חומצות אמינו של שוטון חיידקי המכונה flg22 הוא MAMP טיפוסי הגורם לסגירה סטומטית באמצעות זיהויו על ידי PRR FLS210. כאמצעי נגד, פתוגנים חיידקיים כגון מזרקי Pseudomonas pv. עגבניה DC3000 (Pto) ו-Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria פיתחו מנגנוני אלימות כדי לפתוח מחדש פיוניות 9,11,12. תגובות סטומאטליות אלה לפתוגנים חיידקיים נותחו באופן קונבנציונלי בבדיקות שבהן קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים טבעית המתרחשת בעלה המחובר לצמח.
כאן, מוצגת שיטה פשוטה לחקור סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto במצב המחקה באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים. שיטה זו ממנפת את מכשיר ההדמיה הנייד לתצפית ישירה על פיוניות A. thaliana על עלה המחובר לצמח המחוסן ב-Pto, יחד עם צינור ניתוח התמונה למדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים קודמים השתמשו בקליפות אפידרמיס, דיסקיות עלים או עלים מנותקים כדי לחקור תגובות סטומאטליות לפלישות חיידקים 9,11,12. לעומת זאת, השיטה המוצעת במחקר זה ממנפת את מכשיר הדימות הסטומטלי הנייד כדי לצפות ישירות בפיוניות על עלה המחובר לצמח לאח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל חברי פרויקט המחקר, “יצירה משותפת של תכונות אדפטיביות צמחיות באמצעות הרכבה של הולוביונט צמחי-מיקרובי”, על דיונים פוריים. עבודה זו נתמכה על ידי Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 ו-21H05149 עד A.M. ו-21H05152 ל-Y.T.) ו-Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (22K19178 to A. M).
Materials
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
| Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
| Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
References
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291 (2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576 (2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
