Observation directe et mesure automatisée des réponses stomatiques à Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 chez Arabidopsis thaliana

Les stomates sont des pores microscopiques entourés d’une paire de cellules de garde à la surface des feuilles et d’autres parties aériennes des plantes. Dans des environnements en constante évolution, la régulation de l’ouverture stomatique est essentielle pour que les plantes contrôlent l’absorption de dioxyde de carbone nécessaire à la photosynthèse au détriment de la perte d’eau par transpiration. Ainsi, la quantification de l’ouverture des stomates a été déterminante pour comprendre l’adaptation environnementale des plantes. Cependant, la quantification de l’ouverture stomatique est intrinsèquement longue et fastidieuse car elle nécessite un travail humain pour repérer et mesurer les pores stomatiques dans une image de feuille capturée au microscope. Pour contourner ces limites, diverses méthodes ont été développées pour faciliter la quantification de l’ouverture stomatique chez Arabidopsis thaliana, une plante modèle largement utilisée pour étudier la biologie stomatique 1,2,3,4,5,6. Par exemple, un poromètre peut être utilisé pour mesurer le taux de transpiration comme mesure de la conductance stomatique. Cependant, cette méthode ne fournit pas d’informations directes sur le nombre et l’ouverture des stomates qui déterminent la conductance stomatique. Certaines études ont utilisé des techniques de microscopie confocale mettant en évidence les pores stomatiques à l’aide d’un marqueur d’actine fluorescent, d’un colorant fluorescent ou d’une autofluorescence de la paroi cellulaire 1,2,3,4,5. Bien que ces approches facilitent la détection des stomates, le coût d’exploitation d’une installation de microscopie confocale et de la préparation des échantillons de microscopie peut constituer un obstacle à l’application de routine. Dans le cadre d’un travail novateur de Sai et al., un modèle de réseau neuronal profond a été développé pour mesurer automatiquement l’ouverture des stomates à partir d’images microscopiques en fond clair de peelings épidermiques d’A. thaliana ⁶. Pourtant, cette innovation ne dispense pas les chercheurs de préparer un peeling épidermique pour l’observation microscopique. Récemment, cet obstacle a été surmonté en développant un appareil d’imagerie portable capable d’observer les stomates en pinçant une feuille d’A. thaliana, ainsi qu’un pipeline d’analyse d’images basé sur l’apprentissage profond qui mesure automatiquement l’ouverture des stomates à partir des images de feuilles capturées par l’appareil⁷.

Les stomates contribuent à l’immunité innée des plantes contre les bactéries pathogènes. La clé de cette réponse immunitaire est la fermeture stomatique qui limite l’entrée des bactéries par le pore microscopique à l’intérieur des feuilles, où les bactéries pathogènes prolifèrent et provoquent des maladies⁸. La fermeture stomatique est induite lors de la reconnaissance de modèles moléculaires associés aux microbes (MAMP), des molécules immunogènes souvent communes à une classe de microbes, par des récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) localisés par la membrane ^plasmique9. Un épitope de 22 acides aminés de la flagelline bactérienne connu sous le nom de flg22 est un MAMP typique qui induit la fermeture stomatique grâce à sa reconnaissance par le PRR FLS2¹⁰. En contre-mesure, des bactéries pathogènes telles que Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto) et Xanthomonas campestris pv. Les vésicatories ont développé des mécanismes de virulence pour rouvrir les stomates ^9,11,12. Ces réponses stomatiques aux agents pathogènes bactériens ont été analysées de manière conventionnelle dans des essais dans lesquels des pelures épidermiques de feuilles, des disques foliaires ou des feuilles détachées sont flottés sur une suspension bactérienne, puis les stomates sont observés au microscope suivis d’une mesure manuelle de l’ouverture stomatique. Cependant, ces tests sont lourds et peuvent ne pas refléter les réponses stomatiques à l’invasion bactérienne naturelle qui se produisent dans une feuille attachée à la plante.

Ici, une méthode simple est présentée pour étudier la fermeture et la réouverture des stomates lors de l’invasion de la PTO dans des conditions qui imitent étroitement l’interaction naturelle plante-bactérie. Cette méthode exploite le dispositif d’imagerie portable pour l’observation directe des stomates d’A. thaliana sur une feuille attachée à la plante inoculée avec la Pto, ainsi que le pipeline d’analyse d’images pour la mesure automatisée de l’ouverture des stomates.