Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000
Summary
여기에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 직접 관찰하고 자동으로 측정하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 휴대용 기공 영상 장치와 장치에서 캡처한 잎 이미지를 위해 설계된 이미지 분석 파이프라인을 활용합니다.
Abstract
기공은 식물 잎 표피에서 발견되는 미세한 구멍입니다. 기공 구멍의 조절은 광합성을 위한 이산화탄소 흡수와 증열 수분 손실의 균형을 맞출 뿐만 아니라 박테리아 침입을 제한하는 데에도 중추적인 역할을 합니다. 식물은 미생물을 인식하면 기공을 닫는 반면, 슈도모나스 주사기와 같은 병원성 박테리아는 pv. 토마토 DC3000 (Pto), 닫힌 기공을 다시 열어 잎 내부로 접근합니다. 세균 침입에 대한 기공 반응을 평가하기 위한 기존 분석법에서는 잎 표피 껍질, 잎 디스크 또는 분리된 잎을 박테리아 현탁액에 띄운 다음 현미경으로 기공을 관찰한 후 기공 구멍을 수동으로 측정합니다. 그러나 이러한 분석은 번거롭고 식물에 부착된 잎의 자연적인 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 반영하지 않을 수 있습니다. 최근에는 잎을 식물에서 떼어내지 않고 꼬집어 기공을 관찰할 수 있는 휴대용 영상 장치와 함께 기기로 촬영한 잎 이미지에서 기공 개구를 자동으로 측정하도록 설계된 딥러닝 기반 이미지 분석 파이프라인이 개발되었습니다. 여기에서 이러한 기술적 진보를 바탕으로 애기장대(Arabidopsis thaliana )의 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 평가하는 새로운 방법이 소개되었습니다. 이 방법은 자연 감염 과정을 모방한 Pto 분무 접종, 휴대용 이미징 장치를 사용하여 Pto 접종 식물의 잎에 있는 기공을 직접 관찰하는 방법, 이미지 분석 파이프라인에 의한 기공 개구의 자동 측정의 세 가지 간단한 단계로 구성됩니다. 이 방법은 자연적인 식물-박테리아 상호 작용을 밀접하게 모방하는 조건에서 Pto 침입 중 기공 폐쇄 및 재개를 입증하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
Introduction
기공은 식물의 잎 표면과 다른 공중 부분에 있는 한 쌍의 보호 세포로 둘러싸인 미세한 구멍입니다. 끊임없이 변화하는 환경에서 기공 구멍의 조절은 식물이 증산을 통한 수분 손실을 희생하면서 광합성에 필요한 이산화탄소 흡수를 제어하는 데 중요합니다. 따라서 기공 구멍의 정량화는 식물 환경 적응을 이해하는 데 중요한 역할을 했습니다. 그러나 기공 조리개를 정량화하는 것은 현미경으로 캡처한 잎 이미지에서 기공 기공을 발견하고 측정하기 위해 사람의 노동이 필요하기 때문에 본질적으로 시간이 많이 걸리고 번거롭습니다. 이러한 한계를 피하기 위해, 기공 생물학 1,2,3,4,5,6을 연구하는 데 광범위하게 사용되는 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 기공 구멍의 정량화를 용이하게 하기 위한 다양한 방법이 개발되었습니다. 예를 들어, 기공 전도도의 척도로 증산 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 기공 전도도를 결정하는 기공 수와 구멍에 대한 직접적인 정보를 제공하지 않습니다. 일부 연구에서는 형광 액틴 마커, 형광 염료 또는 세포벽 자가형광 1,2,3,4,5를 사용하여 기공 기공을 강조하는 컨포칼 현미경 기술을 사용했습니다. 이러한 접근법은 기공 검출을 용이하게 하지만, 컨포칼 현미경 검사 시설을 운영하고 현미경 샘플을 준비하는 데 드는 비용은 일상적인 적용에 장애물이 될 수 있습니다. Sai et al.의 획기적인 연구에서는 A. thaliana 표피 껍질의 명시야 현미경 이미지에서 기공 조리개를 자동으로 측정하기 위해 심층 신경망 모델이 개발되었습니다6. 그러나 이러한 혁신이 연구자들이 현미경 관찰을 위해 표피 껍질을 준비하는 작업을 면제하지는 않습니다. 최근에는 A. thaliana의 잎을 꼬집어 기공을 관찰할 수 있는 휴대용 영상 장치와 이 장치에 의해 캡처된 잎 이미지로부터 기공 개구를 자동으로 측정하는 딥러닝 기반 이미지 분석 파이프라인을 개발함으로써 이러한 장애물을 극복할 수 있었다(7).
기공은 박테리아 병원균에 대한 식물의 선천성 면역에 기여합니다. 이 면역 반응의 핵심은 세균성 병원체가 증식하여 질병을 유발하는 미세한 구멍을 통해 잎 내부로 세균이 침투하는 것을 제한하는 기공폐쇄(stomatal closure)이다8. 기공 폐쇄는 원형질막 국소화 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 미생물 종류에 흔히 나타나는 면역원성 분자인 미생물 관련 분자 패턴(MAMP)을 인식할 때 유도됩니다9. flg22로 알려진 박테리아 편모의 22 아미노산 에피토프는 PRR FLS210에 의한 인식을 통해 기공폐쇄를 유도하는 전형적인 MAMP입니다. 이에 대한 대책으로, 슈도모나스 주사기(Pseudomonas syringae) pv와 같은 세균성 병원체. 토마토 DC3000 (Pto)와 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria는 기공 9,11,12를 다시 열기 위해 독성 메커니즘을 진화시켰습니다. 세균성 병원체에 대한 이러한 기공 반응은 잎 표피 껍질, 잎 디스크 또는 분리된 잎을 박테리아 현탁액에 띄운 다음 현미경으로 기공을 관찰한 후 기공 구멍을 수동으로 측정하는 분석법에서 일반적으로 분석되었습니다. 그러나 이러한 분석은 번거롭고 식물에 부착된 잎에서 발생하는 자연적인 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 반영하지 못할 수 있습니다.
여기에서는 자연적인 식물-박테리아 상호 작용을 밀접하게 모방하는 조건에서 Pto 침입 중 기공 폐쇄 및 재개를 조사하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 기공 개구부의 자동 측정을 위한 이미지 분석 파이프라인과 함께 Pto를 접종한 식물에 부착된 잎에서 A. thaliana 기공을 직접 관찰하기 위해 휴대용 이미징 장치를 활용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 연구에서는 세균 침입에 대한 기공 반응을 조사하기 위해 표피 껍질, 잎 디스크 또는 분리된 잎을 사용했다 9,11,12. 대조적으로, 본 연구에서 제안된 방법은 휴대용 기공 영상 장치를 활용하여 Pto를 분무 접종한 후 식물에 부착된 잎의 기공을 직접 관찰하여 박테리아 침입의 자연 조건을 모방합니다. 또한 이 방법은 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
유익한 토론을 해주신 ‘식물-미생물 홀로비온트 조립을 통한 식물 적응 형질의 공동 창조’라는 연구 프로젝트의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 Grant-in-Aid for Transformative Research Areas(21H05151 및 21H05149 – A.M. 및 21H05152 to Y.T.) 및 Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research(22K19178 – A. M.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
| Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
| Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
References
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