الملاحظة المباشرة والقياس الآلي لاستجابات الثغور لحقنة الزائفة الكهروضوئية. طماطم DC3000 في أرابيدوبسيس تاليانا
Summary
نقدم هنا طريقة بسيطة للمراقبة المباشرة والقياس الآلي لاستجابات الثغور للغزو البكتيري في Arabidopsis thaliana. تستفيد هذه الطريقة من جهاز تصوير الفم المحمول ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور المصمم لصور الأوراق التي يلتقطها الجهاز.
Abstract
الثغور هي مسام مجهرية توجد في بشرة أوراق النبات. يعد تنظيم فتحة الثغور أمرا محوريا ليس فقط لموازنة امتصاص ثاني أكسيد الكربون لعملية التمثيل الضوئي وفقدان الماء الناتج عن النتح ولكن أيضا للحد من الغزو البكتيري. بينما تغلق النباتات الثغور عند التعرف على الميكروبات ، فإن البكتيريا المسببة للأمراض ، مثل Pseudomonas syringae pv. طماطم DC3000 (Pto) ، أعد فتح الثغور المغلقة للوصول إلى داخل الورقة. في المقايسات التقليدية لتقييم استجابات الثغور للغزو البكتيري ، يتم تعويم قشور البشرة الورقية أو أقراص الأوراق أو الأوراق المنفصلة على تعليق بكتيري ، ثم يتم ملاحظة الثغور تحت المجهر متبوعا بالقياس اليدوي لفتحة الثغور. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات مرهقة وقد لا تعكس استجابات الثغور للغزو البكتيري الطبيعي في ورقة متصلة بالنبات. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير جهاز تصوير محمول يمكنه مراقبة الثغور عن طريق قرص ورقة دون فصلها عن النبات ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور القائم على التعلم العميق المصمم لقياس فتحة الثغور تلقائيا من صور الأوراق التي يلتقطها الجهاز. هنا ، بناء على هذه التطورات التقنية ، يتم تقديم طريقة جديدة لتقييم استجابات الثغور للغزو البكتيري في Arabidopsis thaliana . تتكون هذه الطريقة من ثلاث خطوات بسيطة: التلقيح بالرش ل Pto الذي يحاكي عمليات العدوى الطبيعية ، والمراقبة المباشرة للثغور على ورقة النبات الملقح ب Pto باستخدام جهاز التصوير المحمول ، والقياس الآلي لفتحة الثغور بواسطة خط أنابيب تحليل الصور. تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لإثبات إغلاق الثغور وإعادة فتحها أثناء غزو Pto في ظل ظروف تحاكي عن كثب التفاعل الطبيعي بين النبات والبكتيريا.
Introduction
الثغور مسام مجهرية محاطة بزوج من الخلايا الحارسة على سطح الأوراق والأجزاء الهوائية الأخرى من النباتات. في ظل البيئات المتغيرة باستمرار ، يعد تنظيم فتحة الثغور أمرا أساسيا للنباتات للتحكم في امتصاص ثاني أكسيد الكربون المطلوب لعملية التمثيل الضوئي على حساب فقدان الماء عن طريق النتح. وبالتالي ، كان القياس الكمي لفتحة الثغور مفيدا لفهم التكيف البيئي للنبات. ومع ذلك ، فإن تحديد فتحة الثغور بطبيعته يستغرق وقتا طويلا ومرهقا لأنه يتطلب عملا بشريا لتحديد وقياس مسام الثغور في صورة ورقة تم التقاطها بواسطة المجهر. للتحايل على هذه القيود ، تم تطوير طرق مختلفة لتسهيل القياس الكمي لفتحة الثغور في Arabidopsis thaliana ، وهو نبات نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الثغور1،2،3،4،5،6. على سبيل المثال، يمكن استخدام البورومتر لقياس معدل النتح باعتباره مقياسا للتوصيل الثغري. ومع ذلك ، لا توفر هذه الطريقة معلومات مباشرة عن عدد الثغور والفتحة التي تحدد التوصيل الثغري. استخدمت بعض الدراسات تقنيات الفحص المجهري متحد البؤر التي تسلط الضوء على مسام الثغور باستخدام علامة الأكتين الفلورية أو صبغة الفلورسنت أو التألق الذاتيلجدار الخلية 1،2،3،4،5. في حين أن هذه الأساليب تسهل الكشف عن الثغور ، فإن تكلفة كل من تشغيل مرفق الفحص المجهري متحد البؤر وإعداد عينات الفحص المجهري يمكن أن تكون عقبة أمام التطبيق الروتيني. في عمل رائد قام به Sai et al. ، تم تطوير نموذج شبكة عصبية عميقة لقياس فتحة الثغور تلقائيا من الصور المجهرية ذات المجال الساطع لتقشير البشرة A. thaliana 6. ومع ذلك ، فإن هذا الابتكار لا يعفي الباحثين من مهمة إعداد قشر البشرة للمراقبة المجهرية. في الآونة الأخيرة ، تم التغلب على هذه العقبة من خلال تطوير جهاز تصوير محمول يمكنه مراقبة الثغور عن طريق قرص ورقة من A. thaliana ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور القائم على التعلم العميق الذي يقيس تلقائيا فتحة الثغور من صور الأوراق التي تم التقاطها بواسطة الجهاز7.
تساهم الثغور في المناعة الفطرية للنبات ضد مسببات الأمراض البكتيرية. مفتاح هذه الاستجابة المناعية هو إغلاق الثغور الذي يقيد دخول البكتيريا من خلال المسام المجهرية إلى داخل الورقة ، حيث تتكاثر مسببات الأمراض البكتيرية وتسبب الأمراض8. يحدث إغلاق الثغور عند التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات (MAMPs) ، وهي جزيئات مناعية غالبا ما تكون شائعة في فئة من الميكروبات ، بواسطة مستقبلات التعرف على الأنماط الموضعية بغشاء البلازما (PRRs) 9. حاتمة 22 من الأحماض الأمينية من السوط البكتيري المعروف باسم flg22 هو MAMP نموذجي يحفز إغلاق الثغور من خلال التعرف عليه من قبل PRR FLS210. كإجراء مضاد ، مسببات الأمراض البكتيرية مثل Pseudomonas syringae pv. طماطم DC3000 (Pto) و Xanthomonas campestris الكهروضوئية. طورت الحويصلة آليات الفوعة لإعادة فتح الثغور9،11،12. تم تحليل استجابات الثغور هذه لمسببات الأمراض البكتيرية بشكل تقليدي في المقايسات التي يتم فيها تعويم قشور البشرة أو أقراص الأوراق أو الأوراق المنفصلة على معلق بكتيري ، ثم يتم ملاحظة الثغور تحت المجهر متبوعا بالقياس اليدوي لفتحة الثغور. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات مرهقة وقد لا تعكس استجابات الثغور للغزو البكتيري الطبيعي الذي يحدث في ورقة متصلة بالنبات.
هنا ، يتم تقديم طريقة بسيطة للتحقيق في إغلاق الثغور وإعادة فتحها أثناء غزو Pto في ظل حالة تحاكي عن كثب التفاعل الطبيعي بين النباتات والبكتيريا. تستفيد هذه الطريقة من جهاز التصوير المحمول للمراقبة المباشرة لثغور A. thaliana على ورقة متصلة بالنبات الملقح ب Pto ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور للقياس الآلي لفتحة الثغور.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدمت الدراسات السابقة تقشير البشرة أو أقراص الأوراق أو الأوراق المنفصلة للتحقيق في استجابات الثغور للغزوات البكتيرية9،11،12. في المقابل ، فإن الطريقة المقترحة في هذه الدراسة تستفيد من جهاز تصوير الثغور المحمول لمراقبة الثغور مباشرة ع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جميع أعضاء المشروع البحثي ، “الإنشاء المشترك للسمات التكيفية للنبات من خلال تجميع holobiont الميكروب النباتي” ، على المناقشات المثمرة. تم دعم هذا العمل من قبل Grant-in-Aid لمجالات البحث التحويلية (21H05151 و 21H05149 إلى AM و 21H05152 إلى YT) و Grant-in-Aid لتحدي البحث الاستكشافي (22K19178 إلى A. M.).
Materials
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
| Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
| Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
References
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291 (2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576 (2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
