Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Estômatos são poros microscópicos cercados por um par de células de guarda na superfície das folhas e outras partes aéreas das plantas. Em ambientes em constante mudança, a regulação da abertura estomática é fundamental para que as plantas controlem a absorção de dióxido de carbono necessária para a fotossíntese às custas da perda de água via transpiração. Assim, a quantificação da abertura estomática tem sido fundamental para o entendimento da adaptação ambiental das plantas. No entanto, quantificar a abertura estomática é inerentemente demorado e complicado, pois requer trabalho humano para detectar e medir poros estomáticos em uma imagem foliar capturada por um microscópio. Para contornar essas limitações, vários métodos têm sido desenvolvidos para facilitar a quantificação da abertura estomática em Arabidopsis thaliana, uma planta-modelo extensivamente utilizada para estudar a biologia estomática1,2,3,4,5,6. Por exemplo, um porômetro pode ser usado para medir a taxa de transpiração como uma métrica de condutância estomática. Entretanto, este método não fornece informações diretas sobre o número estomático e a abertura que determinam a condutância estomática. Alguns estudos utilizaram técnicas de microscopia confocal destacando poros estomáticos utilizando um marcador fluorescente de actina, um corante fluorescente ou autofluorescência da parede celular ^1,2,3,4,5. Embora essas abordagens facilitem a detecção de estômatos, o custo de operar uma instalação de microscopia confocal e preparar amostras de microscopia pode ser um obstáculo para a aplicação de rotina. Em um trabalho pioneiro de Sai et al., um modelo de rede neural profunda foi desenvolvido para medir automaticamente a abertura estomática a partir de imagens microscópicas de campo claro de peelings epidérmicos de A. thaliana ⁶. No entanto, essa inovação não isenta os pesquisadores da tarefa de preparar um peeling epidérmico para observação microscópica. Recentemente, esse obstáculo foi superado com o desenvolvimento de um aparelho portátil de imagem capaz de observar estômatos pinçando uma folha de A. thaliana, juntamente com um pipeline de análise de imagens baseado em aprendizado profundo que mede automaticamente a abertura estomática a partir de imagens foliares capturadas pelo dispositivo⁷.

Os estômatos contribuem para a imunidade inata das plantas contra patógenos bacterianos. A chave para essa resposta imune é o fechamento estomático que restringe a entrada bacteriana através dos poros microscópicos no interior da folha, onde patógenos bacterianos proliferam e causam doenças⁸. O fechamento estomático é induzido pelo reconhecimento de padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs), moléculas imunogênicas que são frequentemente comuns a uma classe de micróbios, por receptores de reconhecimento de padrões localizados na membrana plasmática (PRRs)⁹. Um epítopo de 22 aminoácidos da flagelina bacteriana conhecido como flg22 é um MAMP típico que induz o fechamento estomático através do seu reconhecimento pelo PRR FLS2¹⁰. Como contramedida, patógenos bacterianos como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto) e Xanthomonas campestris pv. vesicatórios desenvolveram mecanismos de virulência para reabrir estômatos9,11,12. Essas respostas estomáticas a patógenos bacterianos têm sido convencionalmente analisadas em ensaios nos quais cascas epidérmicas foliares, discos foliares ou folhas destacadas são flutuadas em suspensão bacteriana e, em seguida, estômatos são observados ao microscópio seguido de medição manual da abertura estomática. No entanto, esses ensaios são pesados e podem não refletir as respostas estomáticas à invasão bacteriana natural que ocorre em uma folha aderida à planta.

Aqui, um método simples é apresentado para investigar o fechamento e a reabertura estomáticos durante a invasão de Pto sob a condição que mimetiza de perto a interação natural planta-bactéria. Este método utiliza o dispositivo portátil de imagem para observação direta de estômatos de A. thaliana em uma folha acoplada à planta inoculada com Pto, juntamente com a tubulação de análise de imagem para medição automatizada da abertura estomática.