Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana
Summary
Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.
Abstract
Huidmondjes zijn microscopisch kleine poriën die worden aangetroffen in de epidermis van het plantenblad. Regulering van de huidmondjesopening is niet alleen van cruciaal belang voor het balanceren van de opname van kooldioxide voor fotosynthese en transpiratief waterverlies, maar ook voor het beperken van bacteriële invasie. Terwijl planten huidmondjes sluiten bij herkenning van microben, pathogene bacteriën, zoals Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (PTO), heropen de gesloten huidmondjes om toegang te krijgen tot het binnenste van de vleugel. In conventionele tests voor het beoordelen van stomatale reacties op bacteriële invasie, worden epidermale peelings van bladeren, bladschijven of losse bladeren op bacteriële suspensie gezweefd en vervolgens worden huidmondjes onder een microscoop geobserveerd, gevolgd door handmatige meting van de huidmondjesopening. Deze tests zijn echter omslachtig en weerspiegelen mogelijk geen huidmondjes op natuurlijke bacteriële invasie in een blad dat aan de plant vastzit. Onlangs is een draagbaar beeldvormingsapparaat ontwikkeld dat huidmondjes kan observeren door in een blad te knijpen zonder het los te maken van de plant, samen met een op deep learning gebaseerde beeldanalysepijplijn die is ontworpen om automatisch de huidmondopening te meten op basis van bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd. Voortbouwend op deze technische vooruitgang wordt hier een nieuwe methode geïntroduceerd om de stomatale respons op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana te beoordelen. Deze methode bestaat uit drie eenvoudige stappen: sprayinoculatie van Pto die natuurlijke infectieprocessen nabootst, directe observatie van huidmondjes op een blad van de Pto-geïnoculeerde plant met behulp van het draagbare beeldvormingsapparaat en geautomatiseerde meting van de huidmondjesopening door de beeldanalysepijplijn. Deze methode werd met succes gebruikt om stomatale sluiting en heropening tijdens Pto-invasie aan te tonen onder omstandigheden die de natuurlijke interactie tussen plant en bacterie nauw nabootsen.
Introduction
Huidmondjes zijn microscopisch kleine poriën omgeven door een paar wachtcellen op het oppervlak van bladeren en andere bovengrondse delen van planten. In steeds veranderende omgevingen is de regulering van de huidmondjesopening van cruciaal belang voor planten om de opname van kooldioxide te regelen die nodig is voor fotosynthese ten koste van waterverlies via transpiratie. De kwantificering van de huidmondjesopening is dus van groot belang geweest voor het begrijpen van de aanpassing van het milieu aan planten. Het kwantificeren van de huidmondjesopening is echter inherent tijdrovend en omslachtig, omdat het menselijke arbeid vereist om stomatale poriën te herkennen en te meten in een bladbeeld dat door een microscoop is vastgelegd. Om deze beperkingen te omzeilen, zijn verschillende methoden ontwikkeld om de kwantificering van de stomatale opening in Arabidopsis thaliana te vergemakkelijken, een modelplant die op grote schaal wordt gebruikt om de stomatale biologie 1,2,3,4,5,6 te bestuderen. Een porometer kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de transpiratiesnelheid te meten als maatstaf voor stomatale geleiding. Deze methode geeft echter geen directe informatie over het huidmondgetal en de opening die de huidmondgeleiding bepalen. Sommige onderzoeken hebben confocale microscopietechnieken gebruikt die de stomatale poriën benadrukken met behulp van een fluorescerende actinemarker, een fluorescerende kleurstof of celwandautofluorescentie 1,2,3,4,5. Hoewel deze benaderingen de detectie van huidmondjes vergemakkelijken, kunnen de kosten van zowel het exploiteren van een confocale microscopiefaciliteit als het voorbereiden van microscopiemonsters een obstakel vormen voor routinematige toepassing. In een baanbrekend werk van Sai et al. werd een diep neuraal netwerkmodel ontwikkeld om automatisch de stomatale opening te meten op basis van helderveldmicroscopische beelden van A. thaliana epidermale peelings6. Toch ontslaat deze innovatie onderzoekers niet van de taak om een epidermale peeling voor te bereiden op microscopische observatie. Onlangs werd dit obstakel overwonnen door een draagbaar beeldvormingsapparaat te ontwikkelen dat huidmondjes kan observeren door in een blad van A. thaliana te knijpen, samen met een op deep learning gebaseerde beeldanalysepijplijn die automatisch de huidmondopening meet op basis van bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd7.
Huidmondjes dragen bij aan de aangeboren immuniteit van planten tegen bacteriële ziekteverwekkers. De sleutel tot deze immuunrespons is stomatale sluiting die het binnendringen van bacteriën door de microscopisch kleine porie in het binnenste van het blad beperkt, waar bacteriële ziekteverwekkers zich vermenigvuldigen en ziekten veroorzaken. Stomatale sluiting wordt geïnduceerd na herkenning van microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMP’s), immunogene moleculen die vaak gemeenschappelijk zijn voor een klasse van microben, door plasmamembraan-gelokaliseerde patroonherkenningsreceptoren (PRR’s)9. Een epitoop van 22 aminozuren van bacterieel flagelline, bekend als flg22, is een typische MAMP die stomatale sluiting induceert door de herkenning ervan door de PRR FLS210. Als tegenmaatregel kunnen bacteriële ziekteverwekkers zoals Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (PTO) en Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria hebben virulentiemechanismen ontwikkeld om huidmondjes te heropenen 9,11,12. Deze huidmondjes op bacteriële pathogenen zijn conventioneel geanalyseerd in tests waarbij epidermale peelings van bladeren, bladschijven of losse bladeren op bacteriële suspensie worden gezweefd en vervolgens huidmondjes worden waargenomen onder een microscoop, gevolgd door handmatige meting van de huidmondjesopening. Deze tests zijn echter omslachtig en weerspiegelen mogelijk geen huidmondjes op natuurlijke bacteriële invasie die optreden in een blad dat aan de plant is bevestigd.
Hier wordt een eenvoudige methode gepresenteerd om stomatale sluiting en heropening tijdens Pto-invasie te onderzoeken onder de voorwaarde die de natuurlijke interactie tussen plant en bacterie nauw nabootst. Deze methode maakt gebruik van het draagbare beeldvormingsapparaat voor directe observatie van A. thaliana huidmondjes op een blad dat is bevestigd aan de plant die is geïnoculeerd met Pto, samen met de beeldanalysepijplijn voor geautomatiseerde meting van de huidmondaopening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere studies gebruikten epidermale schillen, bladschijven of losse bladeren om stomatale reacties op bacteriële invasies te onderzoeken 9,11,12. De methode die in deze studie wordt voorgesteld, maakt daarentegen gebruik van het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat om huidmondjes direct te observeren op een blad dat aan de plant is bevestigd na spray-inoculatie van Pto, waardoor natuurlijke omstandigheden van ba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken alle leden van het onderzoeksproject, ‘Co-creatie van plant adaptieve eigenschappen via assemblage van plant-microbe holobiont’, voor vruchtbare discussies. Dit werk werd ondersteund door Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 en 21H05149 aan AM en 21H05152 aan Y.T.) en Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 aan A. M.).
Materials
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
| Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
| Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
References
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291 (2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576 (2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
