Observación directa y medición automatizada de las respuestas estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 en Arabidopsis thaliana

Los estomas son poros microscópicos rodeados por un par de células protectoras en la superficie de las hojas y otras partes aéreas de las plantas. En entornos en constante cambio, la regulación de la apertura estomática es fundamental para que las plantas controlen la absorción de dióxido de carbono necesaria para la fotosíntesis a expensas de la pérdida de agua a través de la transpiración. Por lo tanto, la cuantificación de la apertura estomática ha sido fundamental para comprender la adaptación ambiental de las plantas. Sin embargo, cuantificar la apertura estomática es inherentemente lento y engorroso, ya que requiere trabajo humano para detectar y medir los poros de los estomas en una imagen de hoja capturada por un microscopio. Para sortear estas limitaciones, se han desarrollado diversos métodos para facilitar la cuantificación de la apertura estomática en Arabidopsis thaliana, una planta modelo ampliamente utilizada para estudiar la biología estomática 1,2,3,4,5,6. Por ejemplo, se puede utilizar un porómetro para medir la tasa de transpiración como medida de la conductancia estomática. Sin embargo, este método no proporciona información directa sobre el número y la apertura de los estomas que determinan la conductancia estomática. Algunos estudios han utilizado técnicas de microscopía confocal que resaltan los poros de los estomas utilizando un marcador de actina fluorescente, un colorante fluorescente o autofluorescencia de la pared celular 1,2,3,4,5. Si bien estos enfoques facilitan la detección de estomas, el costo de operar una instalación de microscopía confocal y preparar muestras de microscopía puede ser un obstáculo para la aplicación rutinaria. En un trabajo pionero de Sai et al., se desarrolló un modelo de red neuronal profunda para medir automáticamente la apertura estomática a partir de imágenes microscópicas de campo claro de exfoliaciones epidérmicas de A. thaliana ⁶. Sin embargo, esta innovación no exime a los investigadores de la tarea de preparar un peeling epidérmico para su observación microscópica. Recientemente, este obstáculo se superó mediante el desarrollo de un dispositivo de imagen portátil que puede observar los estomas pellizcando una hoja de A. thaliana, junto con una tubería de análisis de imágenes basada en el aprendizaje profundo que mide automáticamente la apertura de los estomas a partir de imágenes de hojas capturadas por el dispositivo⁷.

Los estomas contribuyen a la inmunidad innata de las plantas contra los patógenos bacterianos. La clave de esta respuesta inmune es el cierre estomatológico que restringe la entrada bacteriana a través del poro microscópico hacia el interior de la hoja, donde los patógenos bacterianos proliferan y causan enfermedades⁸. El cierre de los estomas se induce tras el reconocimiento de patrones moleculares asociados a microbios (MAMP), moléculas inmunogénicas que a menudo son comunes a una clase de microbios, por parte de los receptores de reconocimiento de patrones localizados en la membrana plasmática (PRR)⁹. Un epítopo de 22 aminoácidos de la flagelina bacteriana conocido como flg22 es un MAMP típico que induce el cierre de los estomas a través de su reconocimiento por el PRR FLS2¹⁰. Como contramedida, los patógenos bacterianos como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto) y Xanthomonas campestris pv. Las vesicatorias han desarrollado mecanismos de virulencia para reabrir los estomas ^9,11,12. Estas respuestas estomáticas a patógenos bacterianos se han analizado convencionalmente en ensayos en los que las cáscaras epidérmicas de las hojas, los discos de las hojas o las hojas desprendidas flotan en suspensión bacteriana, y luego los estamatas se observan bajo un microscopio seguido de una medición manual de la apertura de los estomas. Sin embargo, estos ensayos son engorrosos y pueden no reflejar las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana natural que se produce en una hoja adherida a la planta.

Aquí, se presenta un método simple para investigar el cierre y la reapertura de los estomas durante la invasión de la toma de fuerza bajo la condición que imita de cerca la interacción natural planta-bacteria. Este método aprovecha el dispositivo de imagen portátil para la observación directa de los estomas de A. thaliana en una hoja adherida a la planta inoculada con Pto, junto con la tubería de análisis de imágenes para la medición automatizada de la apertura de los estomas.