ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

1. Klonlama ve protein ekspresyonu İnsan ABCG5 / G8 genini, önceki protokolleri izleyerek Pichia pastoris mayasına klonlayın25,26. Kısaca, pPICZB’den pSGP18 ve pLIC ekspresyon vektörlerini türetin. ABCG8 cDNA’nın (pSGP18-G8-3C-CBP) C-terminaline bir rinovirüs 3C proteaz bölgesini ve ardından bir kalmodulin bağlayıcı peptidi (CBP) kodlayan bir etiket ekleyin.ABCG5 cDNA’nın (pLIC-G5-H12) C-terminaline bir glisin (His 6 GlyHis6) ile ayrılmış altı histidin etiketi ekleyin. Elektroporasyon kullanarak plazmitleri Pichia suşu KM71H’ye birlikte dönüştürün.NOT: Kullanılan plazmitlerin, ortamların ve tamponların ayrıntıları için lütfen Malzeme Tablosuna bakın. Dönüştürülmüş maya hücrelerini MD agar plakalarında 28 °C’de büyütün. 1-2 gün sonra, 10-12 koloni seçin ve bunları küçük ölçekli kültür için 50 mL santrifüj tüpleri kullanarak 10 mL minimal gliserol maya azot bazı (MGY) ortamına aşılayın.Daha iyi havalandırma için santrifüj tüpü kapağında üç küçük delik açın. 600 nm’deki (OD600) optik yoğunluk 10’a ulaşana kadar hücrelerin 28 ° C’de 250 rpm’de sürekli çalkalayarak büyümesine izin verin, genellikle 1-2 gece sürer.NOT: Hücre büyümesi genellikle 12-24 saat sürer. Ertesi gün, 1 L steril MGY ortamı alın ve 2.4 L’lik bir şişede birincil kültürle aşılayın. Şişeyi 28 °C’de bir çalkalayıcı inkübatörde 250 rpm’de 24 saat inkübe edin.pH’ı 5-6 arasında tutmak için, pH stabilize olana kadar% 10 amonyum hidroksit (NH4OH) ekleyin. 1 L kültür başına 1 mL saf metanol (%0,1 (h/h) metanol) ekleyerek pH’ı ayarlayın ve protein ekspresyonunu indükleyin.NOT: Daha sonra hücreleri, toplam 36-48 saat boyunca her 12 saatte bir litre kültür başına 5 mL saf metanol (%0,5 (h/h) metanol) ile besleyin. 4 °C’de 30 dakika boyunca 15.000 x g’da santrifüjleyerek hücreleri hasat edin. Hücre peletlerini toplayın ve bunları lizis tamponunda (0.33 M sükroz, 0.3 M Tris-Cl pH 7.5, 0.1 M aminoheksanoik asit, 1 mM EDTA ve 1 mM EGTA) 0.5 g / mL’lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Süspansiyonu -80 °C’de saklayın. Tipik olarak, 1 L kültürlenmiş hücreden 30 ± 5 g hücre kütlesi geri kazanılabilir.NOT: Hücre peletlerini doğrudan dondurucuda saklayın veya membran preparatları için lizis tamponunda anında yeniden süspansiyon gerçekleştirin. 2. Mikrozomal membranın hazırlanması Hücreleri çözün ve proteaz inhibitörleri ekleyin (2 μg/mL leupeptin, 2 μg/mL pepstatin A, 2 mM PMSF, bkz.Hücreleri daha da parçalamak için, 25.000-30.000 psi’de buzla soğutulmuş bir emülgatör veya mikroakışkanlaştırıcı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Bu işlemi 3-4 kez tekrarlayın. Hücre kalıntılarını gidermek için santrifüjleyin: 15 dakika boyunca 3.500-4.000 x g’da döndürün, ardından 30 dakika boyunca 15.000 x g’de ikinci bir sıkma yapın. Her iki dönüşü de 4 °C’de tutun. Mikrozomal membran veziküllerini izole etmek için, süpernatanı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 2,00,000 °C’de 1.5 saat boyunca 4 x g’de ultrasantrifüjlemeye tabi tutun.Membran peletini 50 mL Tampon A (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM NaCl ve gliserol) içinde bir dounce homojenizatör kullanarak yeniden süspanse edin. Süspansiyonu -80 °C’de saklayın. 3. Heterodimerlerin protein hazırlama-saflaştırılması Donmuş mikrozomal membranları çözün ve çözündürme tamponu kullanarak konsantrasyonu 4-6 mg / mL’ye ayarlayın. Tampon 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, gliserol, %1 (a/h) β-dodesil maltozit (β-DDM), %0.5 (a/h) kolat, %0.1 (a/h) kolesteril hemisüksinat (CHS), 5 mM imidazol, 5 mM β-merkaptoetanol (β-ME), 2 μg/mL leupeptin, 2 μg/mL pepstatin A ve 2 mM PMSF içermelidir (bkz.NOT: Eşit hacimlerde membran preparatı ve çözündürme tamponu karıştırılabilir veya proteaz inhibitörleri ve indirgeyici maddeler olmadan 2x çözündürme tamponu kullanılabilir. Tamponun kısa kaynaması, CHS’nin verimli bir şekilde çözülmesine yardımcı olur. Saflaştırma için sadece 4 °C soğutmalı tampon kullanın.Karışımı 4 °C’de 1 saat orta hızda karıştırın. Bunu, oda sıcaklığında (RT) 20-30 dakika ek karıştırarak takip edin. Çözünmeyen zarları çıkarmak için karışımı 1,00,000 x g’da 30 °C’de 4 dakika santrifüjleyin. Çözünmüş süpernatanı toplayın ve 20 mM imidazol ve 0.1 mM TCEP ekleyin. Afinite kolon kromatografisi26 gerçekleştirin: çözündürülmüş süpernatanı gece boyunca Tampon A’da (adım 2.2.1) önceden dengelenmiş Ni-NTA boncuklarına (10-15 mL) (Malzeme Tablosuna bakın) bağlayın.NOT: Bu noktadan itibaren çalışan arabelleklerde gliserol kullanmaktan kaçının.Kolonu 10 kolon hacmi Tampon B (50 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, %0.1 (a/h) β-DDM, %0.05 (a/h) kolat, %0.01 (a/h) CHS, 0.1 mM TCEP) ile iki kez yıkayın. Kolonu 50 mM imidazol içeren 10 kolon hacmi Tampon B ile yıkayın. Tampon C (200 mM imidazol ile Tampon B) kullanarak proteini çoğaltın. Ayrıştırılan proteinlere 1 mM TCEP (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 10 mM MgCl2 ekleyin. Doğru protein boyutunu26 doğrulamak için bir SDS-PAGE jeli üzerinde ayrıştırılmış fraksiyonları doğrulayın.NOT: Tipik protein verimi (1st Ni-NTA): 6 L kültür başına 10-20 mg protein. DDM’yi kritik misel konsantrasyonunun (CMC) 10x veya 5x’inde, yaklaşık %0,01’inde kullanın. Bu protokol %0,1 DDM kullanır. Ni-NTA elüsyonundan elde edilen pik fraksiyonları eşit hacimde Tampon D1 (1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2 ile Tampon B) ile seyreltin, karıştırın ve protein fraksiyonlarını bir CBP kolonuna yükleyin (3-5 mL) (Malzeme Tablosuna bakınız) CBP yıkama Tamponu D1 ile önceden dengelenmiştir. Tampon D1 ve D2 (1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, %0.1 (a/h) desil-maltoz neopentil glikol (DMNG) ile Tampon B) kullanarak deterjan değiştirmek için CBP kolonunda sıralı yıkamalar gerçekleştirin, β-DDM olmadan: önce 3 kolon hacmi D1 ile yıkayın; ikincisi, 3 sütun hacmi D1:D2 (3:1, v/v) ile yıkayın; üçüncü olarak, 3 sütun hacmi D1:D2 (1:1, v/v) ile yıkayın; dördüncü adım, 3 sütun hacmi D1:D2 (1:3, v/v) ve ardından 6-10 sütun hacmi D2 ile yıkayın. CBP kolonundan 2 mL fraksiyonlarda 300 mM NaCl ile CBP yıkama Tamponu D10 kullanarak proteini elute edin. Ayrıştırılan fraksiyonları 1-2 mL’ye konsantre edin.NOT: Tipik protein verimi (1st CBP), 6 L kültür başına 5-15 mg proteindir. Maltoz neopentil glikol (MNG) deterjanları, 4 °C’de saflaştırılmış protein depolamasını artırır. Hem DMNG hem de Lauril MNG (LMNG) kullanıldı ve DMNG daha iyi X-ışını kırınım kristalleri verdi. DMNG’yi kritik misel konsantrasyonunun (CMC) 10-20 katında, yaklaşık% 0.003’te kullanın. Bu protokol %0.1 DMNG kullandı. CBP elüatının bir kısmı, proteinlerin ATPaz aktivitesini analiz etmek veya transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yoluyla mono-dağılımı değerlendirmek için jel filtrasyon kromatografisi (adım 4.4.) ile daha da saflaştırılabilir. 4. Protein hazırlama-ön kristalizasyon işlemi Sırasıyla endoglikozidaz H (Endo H, 10-15 mg saflaştırılmış protein başına ~ 0.2 mg) ve HRV-3C proteaz (10-15 mg saflaştırılmış protein başına ~ 2 mg) kullanarak N-bağlı glikanları ve CBP etiketlerini ayırın (bkz. Gece boyunca 4 °C’de inkübe edin. Endo H ve 3C proteaz inkübasyonu sırasında, havuzlanmış proteinler üzerinde indirgeyici alkilasyon gerçekleştirin. 4 ° C’de gece boyunca 20 mM iyodoasetamid ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe ederek başlayın. Bunu, buz üzerinde ek 2 mM iyodoasetamid ile 1 saatlik bir inkübasyon ile takip edin.NOT: Bu adım, protein depolamasını 4 °C’de bir aya kadar stabilize eder. Bölünmüş CBP etiketini ayırmak için ikinci bir CBP sütunu (1-2 mL) kullanın. Bu işlem için Buffer D2’yi kullanın.NOT: Tipik protein verimi (2ndCBP ), 6 L kültür başına 5-10 mg proteindir. Jel filtrasyon kromatografisi kullanarak CBP etiketsiz proteini saflaştırın. Tampon 10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, %0.1 (a/h) DMNG, %0.05 (a/h) kolat ve %0.01 (a/h) CHS içermelidir.NOT: Tipik protein verimi (jel filtrasyonu) 6 L kültür başına 2-8 mg proteindir. Bu adım sırasında, jel filtrasyonu sırasında bir DDM tepe noktasının (~65 kD) olmaması, DMNG’ye başarılı deterjan değişimini gösterir. İndirgeyici metilasyon yoluyla havuzlanmış protein fraksiyonlarını değiştirin: proteine 20 mM dimetilamin boran (DMAB, Malzeme Tablosuna bakınız) ve 40 mM formaldehit ekleyin. Salınımlı bir çalkalayıcı üzerinde 4 °C’de 2 saat inkübe edin. 10 mM DMAB ekleyin.10 mM DMAB ilavesi de dahil olmak üzere adım 4.5’i tekrarlayın ve gece boyunca (12-18 saat) 4 °C’de inkübe edin. 100 mM Tris-Cl, pH 7.5 ekleyerek reaksiyonu durdurun. Metillenmiş proteini, 100 mM Tris-Cl, pH 8.0 ve 100 mM NaCl ile önceden dengelenmiş 2 mL Ni-NTA kolonuna yükleyin.Kolonu 10 kolon hacmi yıkama tamponu (10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mg/mL DOPC ILE: DOPE (3:1, a/a), %0.1 (a/h) DMNG, %0.05 (a/h) kolat, %0.01 (a/h) CHS). Elüsyon tamponu (10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 200 mM imidazol, 0.5 mg/mL DOPC: DOPE (1:1, a/a), %0,1 (a/h) DMNG, %0,05 (a/h) kolat, %0,01 (a/h) CHS).NOT: Tipik protein verimi (2nd Ni-NTA), 6 L kültür başına 1-5 mg proteindir. Protein elüatlarını, adım 4.4’te kullanılan tampon ile önceden dengelenmiş bir PD-10 tuzdan arındırma kolonundan geçirin. Tuzdan arındırılmış ve yeniden lipidlenmiş proteini gece boyunca kolesterol (izopropanol veya etanol içinde hazırlanmış) ile ~20 μM’lik bir nihai konsantrasyona kadar inkübe edin.Ertesi sabah, çökelticiyi 1,50,000 °C’de 10 dakika boyunca 4 x g’da ultrasantrifüjleme ile çıkarın. Süpernatanı topla. Proteini, 100 kDa’lık bir kesme santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak 30-50 mg / mL’lik bir nihai konsantrasyona konsantre edin. 4 °C’de 30 dakika boyunca en yüksek hızda tezgah üstü soğutmalı santrifüj kullanarak çökelticiyi çıkarın. Süpernatanı 4 °C’de buz üzerinde tutun ve iki selde kristalleşme koşulları oluşturun.NOT: Konsantre proteinler bir hafta içinde kristal büyümesi için kullanılmalıdır. Proteinleri dondurmayın. 5. İki sellerde protein kristalizasyonu DMPC lipidleri ve CHAPSO deterjan ile 3:1 (a/a) oranında ‘luk bir bicelle stok çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın).NOT: CHAPSO’yu kritik misel konsantrasyonunun (CMC) 5 katında, yaklaşık %0.5’inde kullanın. Bu, protein-bisel karışımındaki CMC’si etrafındaki deterjan konsantrasyonunu korur (adım 5.2).Önceden kurutulmuş lipitlere (% 5 mol kolesterol ve% 95 mol DMPC karışımı) deiyonizeH2O-çözünmüş deterjan (CHAPSO) ekleyin.NOT: Kloroformda çeşitli lipit bileşimleri hazırlayın ve bunları RT’de bir nitrojen gazı akışı kullanarak bir cam test tüpünde kurutun. Artık çözücüleri gece boyunca bir vakum odasına yerleştirerek ince bir lipit tabakası oluşturarak ortadan kaldırın. Bir su banyosu sonikatörü kullanarak lipitleri ve deterjanı yeniden süspanse edin. Çözelti şeffaf hale gelene kadar sürekli güç kullanarak bicelle karışımını buzla soğutulmuş suda sonikleştirin.NOT: İşitme koruması kullanın ve karışımı sıvı fazda tutmak için yeterli buz kaynağı sağlayın. Çözünmemiş bileşenleri 0,2 μm santrifüj filtre ile çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın).NOT: Aliquoted bicelle solüsyonunu -80 °C’de saklayın. çift hücreli (adım 5.1.4) ve proteinleri (adım 4.7.4) 1:4 (v/v) oranında nazikçe birleştirerek ve 5-10 mg/mL arasında bir nihai protein konsantrasyonu elde ederek buz üzerinde bir protein/bisel karışımı oluşturun. Protein ve bicelle karışımını buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. 48 oyuklu plakalar kullanarak asılı damla buhar difüzyon formatında kristalleşme koşullarını ayarlayın.1.6 M-2.0 M amonyum sülfat, 100 mM MES (pH 6.5),% 0 -% 4 PEG 400 ve 1 mM TCEP içeren eşit hacimlerde (0.5 veya 1 μL) protein / bicelle karışımı ve kristalizasyon rezervuar çözeltisini karıştırın (bkz.NOT: Her deneyden önce amonyum sülfat (1.6-2.0 M) ve PEG 400’ü (%0-%4) ayarlayarak rezervuar çözeltisinin bir matrisini oluşturun. 20 °C’de kristalleşme için inkübe edin. Kapak camının düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olmak için ertesi gün kristalizasyon tepsilerini kontrol edin. Kristal büyümesini günde en az bir kez izleyin. Yüksek kaliteli kristaller genellikle 1-2 hafta içinde ortaya çıkar ve 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm boyutlarındadır.NOT: Kristallerin daha düşük protein konsantrasyonlarında oluşması daha uzun sürebilir. Olgun kristaller bir ay içinde hasat edilmelidir. Protein kristallerini 0,2 M sodyum malonat içine batırın ve 50 veya 100 μm kriyo döngüleri kullanarak sıvı nitrojen içinde dondurun.NOT: Bir X-ışını difraktometresi varsa, 5 Å’ye kadar kırınımı ortaya çıkarmak için 15-30 dakikalık X-ışını ışınına maruz kalan birkaç kristali test edin. Daha yüksek çözünürlüklü kırınım, bir senkrotron ışık kaynağı gerektirir. Kriyo-koruyucu olarak 0,2 M sodyum malonat kullanarak, 100 μm x 50 μm x 2 μm ölçülerinde bir kristal, senkrotron X-ışını ile yaklaşık 90 kırınım görüntü çerçevesi sağlayabilir.