התגבשות ABCG5/G8 בסביבת ביצלה ליפידית לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן

1. שיבוט וביטוי חלבונים שבט את הגן האנושי ABCG5/G8 לשמרי Pichia pastoris בהתאם לפרוטוקולים קודמים25,26. בקצרה, לגזור pSGP18 ו pLIC ביטוי וקטורים מ pPICZB. הוסף תג המקודד אתר פרוטאז 3C של rhinovirus ואחריו פפטיד קושר קלמודולין (CBP) למסוף C של ABCG8 cDNA (pSGP18-G8-3C-CBP).הוסף תג שישה היסטידין המופרד על ידי גליצין (6GlyHis6) למסוף C של ABCG5 cDNA (pLIC-G5-H12). הפוך את הפלסמידים לזן פיצ’יה KM71H באמצעות אלקטרופורציה.הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על הפלסמידים, המדיה והמאגרים שבהם נעשה שימוש. לגדל תאי שמרים מותמרים על צלחות אגר MD ב 28 ° C. לאחר 1-2 ימים, בחר 10-12 מושבות וחסן אותן לתוך 10 מ”ל של מדיה מינימלית בסיס חנקן שמרים גליצרול (MGY) באמצעות צינורות צנטריפוגות 50 מ”ל לתרבית בקנה מידה קטן.צרו שלושה חורים קטנים במכסה צינור הצנטריפוגה לאוורור טוב יותר. אפשר לתאים לגדול ב-28°C עם טלטול מתמיד ב-250 סל”ד עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) מגיעה ל-10, בדרך כלל לוקח 1-2 לילות.הערה: צמיחת תאים נמשכת בדרך כלל בין 12-24 שעות. למחרת, קח 1 ליטר של מדיה סטרילית MGY וחסן אותו עם התרבית הראשונית בבקבוק 2.4 ליטר. לדגור את הבקבוק ב 28 ° C ב אינקובטור שייקר ב 250 סל”ד במשך 24 שעות.כדי לשמור על pH בין 5-6, להוסיף 10% אמוניום הידרוקסיד (NH4OH) עד שה- pH מתייצב. התאימו את רמת החומציות וגרמו לביטוי חלבונים על ידי הוספת 1 מ”ל מתנול טהור לכל תרבית של 1 ליטר (0.1% מתנול).הערה: לאחר מכן יש להזין תאים בתרבית מתנול טהור של 5 מ”ל לליטר (0.5% מתנול (v/v) כל 12 שעות למשך זמן כולל של 36-48 שעות. קצור תאים על ידי צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C. יש לאסוף כדורי תאים ולהשהות אותם מחדש במאגר ליזיס (0.33 מ’ סוכרוז, 0.3 מ’ טריס-קל pH 7.5, 0.1 מ’ חומצה אמינוהקסנואית, 1 מ”מ EDTA ו-1 מ”מ EGTA) לריכוז של 0.5 גרם/מ”ל. אחסנו את המתלים בטמפרטורה של -80°C. בדרך כלל, ניתן לשחזר 30 ± 5 גרם של מסת התא מ 1 L של תאים בתרבית.הערה: יש לאחסן כדורי תאים ישירות במקפיא או לבצע השעיה מיידית במאגר ליזיס לתכשירי ממברנה. 2. הכנת קרום מיקרוזומלי הפשירו את התאים והוסיפו מעכבי פרוטאז (2 מיקרוגרם/מ”ל לאופפטין, 2 מיקרוגרם/מ”ל פפסטטין A, 2 מ”מ PMSF, ראו טבלת חומרים).כדי לקדם את תאי הליזה, השתמש במתחלב או מיקרופלואיזר מקורר קרח (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורה של 25,000-30,000 psi. חזור על תהליך זה 3-4 פעמים. צנטריפוגה לסילוק פסולת תאים: סחרור במהירות 3,500-4,000 x גרם במשך 15 דקות, ולאחר מכן סיבוב שני במהירות 15,000 x גרם למשך 30 דקות. שמור על שני הסיבובים ב 4 ° C. כדי לבודד שלפוחיות קרום מיקרוזומליות, העבר את הסופרנאטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגות וחשף אותו לאולטרה-צנטריפוגה ב -2,00,000 x גרם למשך 1.5 שעות ב -4 מעלות צלזיוס.יש להשהות מחדש את כדורית הממברנה ב-50 מ”ל של Buffer A (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM NaCl ו-10% גליצרול) באמצעות הומוגנייזר מקפץ. אחסנו את המתלים בטמפרטורה של -80°C. 3. חלבון הכנה-טיהור של heterodimers הפשירו את הקרומים המיקרוזומליים הקפואים, והתאימו את הריכוז ל-4-6 מ”ג/מ”ל באמצעות מאגר מסיסות. המאגר צריך להכיל 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10% גליצרול, 1% (w/v) β-דודציל מלטוזיד (β-DDM), 0.5% (w/v) cholate, 0.1% (w/v) cholesteryl hemisuccinate (CHS), 5 mM imidazole, 5 mM β-mercaptoethanol (β-ME), 2 μg/mL leupeptin, 2 μg/mL pepstatin A ו-2 mM PMSF (ראה טבלת חומרים).הערה: ניתן לערבב נפחים שווים של הכנת הממברנה ומאגר המסיסות, או להשתמש במאגר מסיסות פי 2 ללא מעכבי פרוטאז וחומרים מחזרים. רתיחה קצרה של החיץ מסייעת להמיס CHS ביעילות. לטיהור, יש להשתמש רק במאגר המקורר בטמפרטורה של 4°C.ערבבו את התערובת במהירות בינונית במשך שעה אחת ב-4°C. לאחר מכן יש להוסיף ערבוב נוסף בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20-30 דקות. צנטריפוגה את התערובת ב 1,00,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר ממברנות בלתי מסיסות. אספו את הסופרנאטנט המסיס והוסיפו 20 mM imidazole ו-0.1 mM TCEP. ביצוע כרומטוגרפיה של עמודת זיקה26: קשרו את הסופרנאטנט המסיס לחרוזי Ni-NTA משווי משקל מראש (10-15 מ”ל) (ראה טבלת חומרים) בחיץ A (שלב 2.2.1) למשך הלילה.הערה: הימנע משימוש בגליצרול במאגרי ריצה מנקודה זו ואילך.שטפו את העמודה פעמיים עם 10 נפחי עמודות של Buffer B (50 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% (w/v) β-DDM, 0.05% (w/v) cholate, 0.01% (w/v) CHS, 0.1 mM TCEP) המכילים 25 mM imidazole. שטף את העמודה עם 10 כרכי עמודות של Buffer B המכילים 50 mM imidazole. יש להקפיד על החלבון באמצעות Buffer C (Buffer B עם 200 mM imidazole). הוסף 1 mM TCEP (ראה טבלה של חומרים) ו 10 mM MgCl2 לחלבונים מדוללים. אמת את השברים המדוללים בג’ל SDS-PAGE כדי לאשר את גודל החלבון הנכון26.הערה: תפוקת חלבון אופיינית (1st Ni-NTA): 10-20 מ”ג חלבון לכל תרבית של 6 ליטר. יש להשתמש ב-DDM בריכוז המיצלה הקריטי (CMC) פי 10 או 5x, כ-0.01%. פרוטוקול זה משתמש ב-0.1% DDM. לדלל את שברי השיא מאלוציית Ni-NTA עם נפח שווה של Buffer D1 (Buffer B עם 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2), לערבב ולהעמיס את שברי החלבונים על עמודת CBP (3-5 מ”ל) (ראה טבלת חומרים) ששוותה מראש עם CBP wash Buffer D1. בצע שטיפות רציפות על עמודת CBP כדי להחליף חומרי ניקוי באמצעות Buffer D1 ו-D2 (Buffer B עם 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 0.1% (w/v) דציל-מלטוז נאופנטיל גליקול (DMNG), ללא β-DDM): ראשית, שטוף עם 3 נפחי עמודות של D1; שנית, יש לכבס עם 3 כרכי עמודות של D1:D2 (3:1, v/v); שלישית, לכבס עם 3 כרכי עמודות של D1:D2 (1:1, v/v); שלב רביעי, שטף עם 3 כרכי עמודות של D1:D2 (1:3, v/v), ואחריו אמצעי אחסון של 6-10 עמודות של D2. יש להקפיד על החלבון באמצעות CBP לשטוף Buffer D2 עם 300 mM NaCl בשברים של 1 מ”ל מעמודת CBP (סה”כ 10 מ”ל). רכז את השברים המדוללים ל 1-2 מ”ל.הערה: תפוקת החלבון האופיינית (1st CBP) היא 5-15 מ”ג חלבון לכל תרבית של 6 ליטר. דטרגנטים מלטוז נאופנטיל גליקול (MNG) משפרים את אחסון החלבון המטוהר ב-4°C. נעשה שימוש הן ב-DMNG והן ב-Lauryl MNG (LMNG), כאשר DMNG הניב גבישי עקיפה טובים יותר של קרני רנטגן. השתמש DMNG ב 10-20x של ריכוז מיצלה קריטי שלה (CMC), כ 0.003%. פרוטוקול זה השתמש ב- 0.1% DMNG. חלק קטן מפליטת CBP יכול להיות מטוהר עוד יותר על ידי כרומטוגרפיית סינון ג’ל (שלב 4.4.) כדי לנתח את פעילות ATPase של חלבונים או להעריך פיזור מונו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM). 4. הכנת חלבונים-טיפול טרום התגבשות נתקעו את תגי הגליקנים וה-CBP המקושרים ל-N באמצעות אנדוגליקוזידאז H (אנדו H, ~0.2 מ”ג ל-10-15 מ”ג חלבון מטוהר) ופרוטאז HRV-3C (~2 מ”ג ל-10-15 מ”ג חלבון מטוהר), בהתאמה (ראו טבלת חומרים). לדגור לילה ב 4 °C (75 °F). במהלך הדגירה של אנדו H ופרוטאז 3C, בצעו אלקילציה רדוקטיבית על החלבונים המאוגרים. יש להתחיל בדגירה עם יודואצטמיד במינון 20 mM (ראו טבלת חומרים) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן יש לדגור שעה אחת עם יודואצטמיד נוסף של 2 mM על קרח.הערה: שלב זה מייצב עוד יותר את אחסון החלבון למשך עד חודש ב-4°C. השתמש בעמודת CBP שנייה (1-2 מ”ל) כדי להפריד את תג ה- CBP השסוע. השתמש במאגר D2 עבור תהליך זה.הערה: תפוקת החלבון האופיינית (2nd CBP) היא 5-10 מ”ג חלבון לכל תרבית של 6 ליטר. לטהר את החלבון ללא תגי CBP באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג’ל. המאגר צריך להכיל 10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% (w/v) DMNG, 0.05% (w/v) cholate ו-0.01% (w/v) CHS.הערה: תפוקת החלבון האופיינית (סינון ג’ל) היא 2-8 מ”ג חלבון לכל תרבית של 6 ליטר. במהלך שלב זה, היעדר שיא DDM (~ 65 kD) במהלך סינון ג’ל מצביע על החלפת חומרי ניקוי מוצלחת ל- DMNG. שנה את מקטעי החלבון המצטברים באמצעות מתילציה רדוקטיבית: הוסף 20 mM dimethylamine borane (DMAB, ראה טבלה של חומרים) ו 40 mM פורמלדהיד לחלבון. יש לדגור במשך שעתיים ב-4°C על שייקר מתנודד. הוסף 10 mM DMAB.חזור על שלב 4.5, כולל תוספת של 10 mM DMAB, ודגור לילה (12-18 שעות) ב 4 ° C. עצור את התגובה על ידי הוספת 100 mM Tris-Cl, pH 7.5. טען את החלבון שעבר מתילציה על עמודת Ni-NTA של 2 מ”ל שוות ערך מראש עם 100 mM Tris-Cl, pH 8.0 ו-100 mM NaCl.שטוף את העמודה באמצעות 10 נפחי עמודות של מאגר כביסה (10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, עם 0.5 מ”ג/מ”ל DOPC: סמים (3:1, w/w), 0.1% (w/v) DMNG, 0.05% (w/v) cholate, 0.01% (w/v) CHS). יש להקפיד על החלבון השומני באמצעות חיץ אלוציה (10 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 200 mM imidazole, 0.5 מ”ג/מ”ל DOPC: סמים (1:1, w/w), 0.1% (w/v) DMNG, 0.05% (w/v) cholate, 0.01% (w/v) CHS).הערה: תפוקת החלבון האופיינית (2nd Ni-NTA) היא 1-5 מ”ג חלבון לכל תרבית של 6 ליטר. מעבירים את החלבון דרך עמודת התפלה PD-10 המאוזנת מראש עם החיץ המשמש בשלב 4.4. לדגור על חלבון מותפל ושומנים למשך הלילה עם כולסטרול (מוכן איזופרופנול או אתנול) לריכוז סופי של ~ 20 מיקרומטר.למחרת בבוקר, להסיר את המשקע על ידי ultracentrifugation ב 1,50,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (75 °F). לאסוף את supernatant. רכז את החלבון לריכוז סופי של 30-50 מ”ג/מ”ל באמצעות רכז צנטריפוגלי בחיתוך של 100 kDa . הסר את המשקע באמצעות צנטריפוגה מקוררת במהירות הגבוהה ביותר למשך 30 דקות ב- 4 ° C. שמור את supernatant על קרח ב 4 ° C וליצור תנאי התגבשות bicelles.הערה: יש להשתמש בחלבונים המרוכזים לגדילת גבישים תוך שבוע. אין להקפיא את החלבונים. 5. התגבשות חלבונים בביצלות הכינו תמיסת ציר 10% ביצלה עם ליפידים DMPC וחומר ניקוי CHAPSO ביחס של 3:1 (w/w) (ראו טבלת חומרים).הערה: יש להשתמש ב-CHAPSO בריכוז מיצלה קריטי (CMC) פי 5, כ-0.5%. זה שומר על ריכוז חומרי ניקוי סביב CMC שלה בתערובת חלבון-bicelle (שלב 5.2).הוסף חומר ניקוי מומס H2O שעבר דה-יוניזציה (CHAPSO) לשומנים מיובשים מראש (תערובת של 5 מול% כולסטרול ו-95 מול-DMPC).הערה: הכינו הרכבי שומנים שונים בכלורופורם, וייבשו אותם במבחנה מזכוכית באמצעות זרם גז חנקן ב-RT. סלקו שאריות ממיסים על ידי הכנסתם לתא ואקום למשך הלילה, ויצרו שכבת שומנים דקה. יש להשהות מחדש שומנים וחומרי ניקוי באמצעות סוניק אמבט מים. ערבבו את תערובת הביצלה במים צוננים כקרח בעוצמה רציפה עד שהתמיסה הופכת לשקופה.הערה: יש להשתמש בהגנה על השמיעה ולהבטיח אספקת קרח מספקת כדי לשמור על התערובת בפאזה נוזלית. הסר רכיבים לא מומסים באמצעות מסנן צנטריפוגלי של 0.2 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).הערה: אחסן את תמיסת bicelle aliquoted ב -80 ° C. צרו תערובת חלבון/ביצלה על קרח על ידי שילוב עדין של 10% ביצלות (שלב 5.1.4) וחלבונים (שלב 4.7.4) ביחס של 1:4 (v/v), והשיגו ריכוז חלבון סופי בין 5-10 מ”ג/מ”ל. דוגרים על תערובת החלבונים והביצלה על קרח במשך 30 דקות. הגדר תנאי התגבשות בפורמט דיפוזיה של אדי טיפה תלויה באמצעות לוחות 48 בארות.ערבבו נפחים שווים (0.5 או 1 מיקרוליטר) של תערובת חלבון/ביצלה ותמיסת מאגר התגבשות המכילה 1.6 M-2.0 M אמוניום סולפט, 100 mM MES (pH 6.5), 0%-4% PEG 400 ו-1 mM TCEP (ראו טבלת חומרים).הערה: צור מטריצה של תמיסת המאגר לפני כל ניסוי, תוך התאמת אמוניום סולפט (1.6-2.0 מטר) ו-PEG 400 (0%-4%). דגירה להתגבשות ב 20 מעלות צלזיוס. בדקו את מגשי ההתגבשות למחרת כדי לוודא איטום זכוכית כיסוי מתאים. עקוב אחר גדילת הגביש לפחות פעם ביום. גבישים באיכות גבוהה מופיעים בדרך כלל תוך 1-2 שבועות, בגודל 50-150 מיקרומטר x 20-50 מיקרומטר x 2-5 מיקרומטר.הערה: ייתכן שיחלוף זמן רב יותר להיווצרות גבישים בריכוזי חלבון נמוכים יותר. גבישים בוגרים יש לקצור בתוך חודש. השרו גבישי חלבון ב-0.2 M נתרן מלונט והקפיאו אותם בחנקן נוזלי באמצעות 50 או 100 מיקרומטר cryo-loops.הערה: אם קיים דיפרקטומטר רנטגן, בדוק כמה גבישים עם חשיפה לקרן רנטגן של 15-30 דקות כדי לחשוף עקיפה של עד 5 Å. עקיפה ברזולוציה גבוהה יותר דורשת מקור אור סינכרוטרון. באמצעות 0.2 M נתרן malonate כמו הגנה cryo, גביש בגודל 100 מיקרומטר x 50 מיקרומטר x 2 מיקרומטר יכול לספק סביב 90 מסגרות תמונה עקיפה עם רנטגן סינכרוטרון.