Este protocolo descreve um setup para a cristalização do transportador de esterol ABCG5/G8. ABCG5/G8 é reconstituído em bicelas para cristalização em gota suspensa. O protocolo não requer materiais ou substratos especializados, tornando-o acessível e de fácil adaptação em qualquer laboratório para determinação da estrutura da proteína através da cristalografia de raios X.
Os transportadores de ligante de ATP (ABC) constituem proteínas de membrana emblocadas em lipídios. A extração dessas proteínas de membrana da bicamada lipídica para um ambiente aquoso é tipicamente obtida empregando detergentes. Esses detergentes desintegram a bicamada lipídica e solubilizam as proteínas. O habitat intrínseco das proteínas de membrana dentro da bicamada lipídica representa um desafio na manutenção de sua estabilidade e uniformidade em solução para caracterização estrutural. As bicelas, que compreendem uma mistura de fosfolipídios e detergentes de cadeia longa e curta, replicam a estrutura lipídica natural. A utilização de bicelos lipídicos e detergentes serve como um sistema modelo adequado para a obtenção de cristais de difração de alta qualidade, especificamente para determinar a estrutura de alta resolução de proteínas de membrana. Através desses microambientes sintéticos, as proteínas de membrana preservam sua conformação e funcionalidade nativas, facilitando a formação de cristais tridimensionais. Nesta abordagem, o heterodimérico ABCG5/G8 solubilizado em detergente foi reintegrado às células DMPC/CHAPSO, suplementadas com colesterol. Este arranjo foi empregado no procedimento experimental de difusão de vapor para cristalização de proteínas.
Os transportadores de ligantes de ATP (ABC) constituem uma superfamília de proteínas de membrana responsáveis por diversos processos de transporte dependentes de ATP através de membranas biológicas 1,2,3,4,5. Essas proteínas transportadoras estão implicadas em doenças cardiovasculares e desempenham um papel significativo na facilitação do efluxo de colesterol para a bile para posterior excreção no fígado. Consequentemente, o metabolismo e o equilíbrio do colesterol têm despertado considerável interesse ao longo dos anos6. Um mecanismo específico envolvido na eliminação de colesterol e outros esteróis do organismo envolve membros da subfamília ABCG humana, notadamente o heterodimérico ABCG5/G8 7,8,9,10. Mutações em qualquer um desses genes interrompem o heterodímero, levando à perda de função e causando sitosterolemia, um distúrbio que afeta o tráfico de esteróis11,12,13. Dada a relevância da doença e seu papel na promoção do efluxo de colesterol, os transportadores de esteróis têm atraído atenção significativa. No entanto, os intrincados detalhes de seu mecanismo molecular e seletividade de substratos permanecem em grande parte não revelados. Assim, a elucidação da estrutura cristalina de ABCG5/G8 é um passo crucial para a compreensão dos mecanismos e funções a jusante no transporte de colesterol.
As proteínas de membrana requerem ancoragem dentro das membranas para dobrar e funcionar corretamente. Consequentemente, a extração de proteínas de membrana de seu ambiente natural frequentemente resulta em instabilidade proteica, enovelamento incorreto e perda de função14,15. Esses desafios ressaltam os principais obstáculos enfrentados na cristalização de proteínas de membrana. Entretanto, a reconstituição de proteínas em bicamadas detergentes sintéticos, como as bicelas, surgiu como solução para essa situação, possibilitando a manutenção de proteínas de membrana em um meio bicamadanativo16. Bicelos são conjuntos de fosfolipídios e detergentes sintéticos suspensos e solubilizados em água. Notadamente, adotam uma estrutura bicamada que mimetiza membranas biológicas16,17,18. As bicelas podem transitar entre as fases líquida e gel com base na temperatura e viscosidade. A cristalização da bicela capitaliza os pequenos discos de bicamada e a baixa viscosidade a temperaturas reduzidas, facilitando a mistura completa de proteínas e soluções de bicela. O tamanho das bicelas depende da relação detergente/lipídio durante o preparo19,20. Os detergentes prevalentes para a formação de bicelas incluem 3-[(3-colelamidopropil)dimetilamônio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO), juntamente com 3-[(3-colelamidopropil)dimetilamônio]-1-propanossulfonato (CHAPS) e 1,2-ditridecanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DHPC)21. Estes detergentes são usados em conjunto com lipídios como di-miristoil-fosfatidilcolina (DMPC) e 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC). Além disso, estudos recentes têm demonstrado a plena funcionalidade das proteínas de membrana dentro das células sob condições fisiológicas. Por exemplo, Lee e colaboradores cristalizaram e relataram com sucesso a estrutura cristalina de ABCG5/ABCG8 com base em uma bicamada lipídica22,23. No processo de cristalização, misturas proteína-bicela podem ser acomodadas usando equipamentos padrão, incluindo robôs de cristalização de alto rendimento24. A viabilidade da utilização de bicelos, no entanto, depende da termoestabilidade das proteínas devido às condições de cristalização em temperaturas mais elevadas. No entanto, quando comparadas a outras técnicas, as condições de cristalização necessárias para proteínas de membrana geralmente permanecem leves, envolvendo baixas concentrações de precipitante, sal e tampão. Isso torna as misturas proteína-bicela e a difusão de vapor ferramentas eficazes e facilmente implementáveis para estudos estruturais de proteínas de membrana.
Este protocolo descreve etapas essenciais na preparação de proteínas e cristalização de bicelas para a determinação da estrutura cristalina de raios X de ABCG5/G8 em alta resolução (Figura 1).
Os desafios associados à cristalização de proteínas de membrana têm motivado o desenvolvimento de métodos de cristalização baseados em bicamadas lipídicas, como a abordagem da bicela27 ou da fase cúbica lipídica (LCP)14 . No entanto, alcançar a cristalização bem-sucedida de proteínas de membrana ainda depende da etapa crítica e, às vezes, afunilamento da preparação de proteínas. Notavelmente, os transportadores ABC apresentam um formidável obstáculo no crescimento de cristais adequados para cristalografia de raios X. Este protocolo fornece orientação prática abrangente para simplificar a preparação do transportador de esterol ABCG5/G8 humano e promover o crescimento de cristais através da abordagem de cristalização de bicela.
Uma consideração fundamental na elaboração deste protocolo foi o imperativo de um rendimento proteico substancial nas fases iniciais de purificação proteica, permitindo um certo grau de perda proteica durante o tratamento de pré-cristalização (Figura 3). Estratégias comuns para enfrentar esse desafio envolvem engenharia extensiva de proteínas, utilização de diversos hospedeiros de expressão e exploração de ortólogos ou homólogos, entre outras abordagens. No entanto, com este procedimento aparentemente intrincado, uma série de etapas fundamentais foram identificadas que sustentam o sucesso do protocolo e também fornecem insights sobre possíveis limitações que podem surgir ao estudar outros transportadores ABC ou proteínas de membrana em geral.
Em primeiro lugar, este protocolo emprega centrifugação completa em cada etapa para minimizar a agregação proteica. Além disso, o monitoramento contínuo da termoestabilidade das proteínas purificadas é crucial. A microscopia eletrônica é utilizada para verificar a monodispersão de proteínas, enquanto a filtração analítica em gel rastreia a estabilidade da proteína ao longo do tempo (Figura 2). Técnicas alternativas como dicroísmo circular (CD) ou calorimetria exploratória diferencial (DSC) também poderiam ser incorporadas. Além disso, a incorporação de lipídios em estágios específicos é essencial para maximizar tanto a atividade quanto a cristalogênese do ABCG5/G8 purificado. Por exemplo, colato e CHS são necessários para exibir hidrólise de ATP mensurável; fosfolipídios são indispensáveis para manter a estabilidade das proteínas metiladas; e o colesterol é um componente necessário da solução da bicela, promovendo o crescimento de cristais adequados para difração de raios X de alta resolução (Figura 4).
Em essência, todo o procedimento pode ser realizado dentro de uma semana de esforço. Em contraste com o LCP, a recuperação de cristais de bandejas de cristalização de gotas suspensas é simples. Olhando para o futuro, com um rendimento proteico substancial (aproximadamente 10 mg), este protocolo é facilmente adaptável para o desenvolvimento de investigações cristalográficas envolvendo mutantes ABCG5/G8 ou outras proteínas transportadoras. Isso é particularmente pertinente para os casos que atualmente escapam à visualização por microscopia eletrônica.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado por uma Bolsa de Descoberta do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (RGPIN 2018-04070) e uma Bolsa de Projeto de Pesquisa do Canadian Institutes of Health (PJT-180640) para JYL. Este protocolo é baseado nos relatos originais em estruturas cristalinas ABCG5/G8 relatados anteriormente por Farhat et al.22 e Lee et al.23.
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |