Este protocolo describe una configuración para la cristalización del transportador de esteroles ABCG5/G8. ABCG5/G8 se reconstituye en biceles para la cristalización en gotas colgantes. El protocolo no requiere materiales ni sustratos especializados, por lo que es accesible y fácil de adaptar en cualquier laboratorio para la determinación de la estructura de la proteína mediante cristalografía de rayos X.
Los transportadores de casetes de unión a ATP (ABC) constituyen proteínas de membrana incluidas en lípidos. La extracción de estas proteínas de membrana de la bicapa lipídica a un ambiente acuoso se logra típicamente mediante el empleo de detergentes. Estos detergentes desintegran la bicapa lipídica y solubilizan las proteínas. El hábitat intrínseco de las proteínas de membrana dentro de la bicapa lipídica plantea un desafío para mantener su estabilidad y uniformidad en solución para la caracterización estructural. Las bicelas, que comprenden una mezcla de fosfolípidos y detergentes de cadena larga y corta, replican la estructura lipídica natural. La utilización de bicelas lipídicas y detergentes sirve como un sistema modelo adecuado para obtener cristales de difracción de alta calidad, específicamente para determinar la estructura de alta resolución de las proteínas de membrana. A través de estos microambientes sintéticos, las proteínas de membrana conservan su conformación y funcionalidad nativas, facilitando la formación de cristales tridimensionales. En este enfoque, el heterodimérico solubimérico ABCG5/G8 con detergente se reintegró en las bicelas de DMPC/CHAPSO, suplementadas con colesterol. Esta configuración se empleó en el procedimiento experimental de difusión de vapor para la cristalización de proteínas.
Los transportadores de casetes de unión a ATP (ABC) constituyen una superfamilia de proteínas de membrana responsables de diversos procesos de transporte dependientes de ATP a través de membranas biológicas 1,2,3,4,5. Estas proteínas transportadoras están implicadas en las enfermedades cardiovasculares y desempeñan un papel importante en la facilitación del flujo de colesterol a la bilis para su posterior excreción en el hígado. En consecuencia, el metabolismo y el equilibrio del colesterol han despertado un interés considerable a lo largo de los años6. Un mecanismo específico implicado en la eliminación del colesterol y otros esteroles del organismo afecta a miembros de la subfamilia humana ABCG, en particular el heterodimérico ABCG5/G8 7,8,9,10. Las mutaciones en cualquiera de estos genes alteran el heterodímero, lo que lleva a la pérdida de la función y causa sitosterolemia, un trastorno que afecta el tráfico de esteroles11,12,13. Dada la relevancia de la enfermedad y su papel en la promoción del flujo de colesterol, los transportadores de esteroles han atraído una atención significativa. Sin embargo, los intrincados detalles de su mecanismo molecular y selectividad de sustrato permanecen en gran medida sin revelar. Por lo tanto, la elucidación de la estructura cristalina de ABCG5/G8 es un paso crucial hacia la comprensión de los mecanismos y las funciones posteriores en el transporte de colesterol.
Las proteínas de membrana requieren anclaje dentro de las membranas para plegarse y funcionar correctamente. En consecuencia, la extracción de proteínas de membrana de su entorno natural a menudo resulta en inestabilidad proteica, plegamiento incorrecto y pérdida de función14,15. Estos desafíos subrayan los principales obstáculos a los que se enfrenta la cristalización de proteínas de membrana. Sin embargo, la reconstitución de proteínas en bicapas de detergente sintético, como las bicelas, ha surgido como una solución a esta situación, permitiendo el mantenimiento de proteínas de membrana dentro de un entorno bicapa similar al nativo16. Las bicelas son conjuntos de fosfolípidos y detergentes sintéticos suspendidos y solubilizados en agua. En particular, adoptan una estructura bicapa que imita las membranas biológicas16,17,18. Las bicelas pueden pasar entre fases líquidas y de gel en función de la temperatura y la viscosidad. La cristalización de la bicela aprovecha los pequeños discos bicapa y la baja viscosidad a temperaturas reducidas, lo que facilita la mezcla completa de proteínas y soluciones de bicelle. El tamaño de las bicelas depende de la relación detergente/lípidos durante la preparación 19,20. Los detergentes prevalentes para la formación de bicelas incluyen 3-[(3-cholamidopropil)dimetilammonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO), junto con 3-[(3-colamidopropil)dimetilammonio]-1-propanosulfonato (CHAPS) y 1,2-ditridecanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DHPC)21. Estos detergentes se utilizan junto con lípidos como la di-miristoil-fosfatidilcolina (DMPC) y la 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC). Además, estudios recientes han demostrado la plena funcionalidad de las proteínas de membrana dentro de las bicelas en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, Lee y sus colegas cristalizaron con éxito e informaron de la estructura cristalina de ABCG5/ABCG8 basándose en una bicapa lipídica22,23. En el proceso de cristalización, las mezclas de proteínas y bicelas pueden acomodarse utilizando equipos estándar, incluidos los robots de cristalización de alto rendimiento24. Sin embargo, la viabilidad de utilizar bicelas depende de la termoestabilidad de las proteínas debido a las condiciones de cristalización a temperaturas más altas. Sin embargo, en comparación con otras técnicas, las condiciones de cristalización requeridas para las proteínas de membrana generalmente siguen siendo suaves, involucrando bajas concentraciones de precipitante, sal y tampón. Esto hace que tanto las mezclas de proteínas y bicelas como la difusión de vapor sean herramientas efectivas y fáciles de implementar para estudios estructurales de proteínas de membrana.
Este protocolo describe los pasos esenciales en la preparación de proteínas y la cristalización de bicelas para determinar la estructura cristalina de rayos X de ABCG5/G8 a alta resolución (Figura 1).
Los desafíos asociados con la cristalización de proteínas de membrana han impulsado el desarrollo de métodos de cristalización impulsados por bicapas lipídicas, como los enfoques de la bicela27 o la fase cúbica lipídica (LCP)14 . Sin embargo, lograr una cristalización exitosa de las proteínas de membrana todavía depende del paso crítico y a veces atascado de la preparación de proteínas. En particular, los transportadores ABC presentan un obstáculo formidable en el crecimiento de cristales adecuados para la cristalografía de rayos X. Este protocolo proporciona una guía práctica completa para agilizar la preparación del transportador de esteroles ABCG5 / G8 humano y fomentar el crecimiento de cristales a través del enfoque de cristalización de bicela.
Una consideración clave en el diseño de este protocolo fue el imperativo de un rendimiento proteico sustancial en las fases iniciales de la purificación de proteínas, lo que permite un cierto grado de pérdida de proteínas durante el tratamiento previo a la cristalización (Figura 3). Las estrategias comunes para abordar este desafío incluyen una extensa ingeniería de proteínas, la utilización de diversos hospedadores de expresión y la exploración de ortólogos u homólogos, entre otros enfoques. Sin embargo, con este procedimiento aparentemente intrincado, se han identificado una serie de pasos fundamentales que sustentan el éxito del protocolo y también proporcionan información sobre las posibles limitaciones que pueden surgir al estudiar otros transportadores ABC o proteínas de membrana en general.
En primer lugar, este protocolo emplea una centrifugación exhaustiva en cada paso para minimizar la agregación de proteínas. Además, el monitoreo continuo de la termoestabilidad de las proteínas purificadas es crucial. La microscopía electrónica se utiliza para verificar la monodispersidad de proteínas, mientras que la filtración analítica en gel rastrea la estabilidad de las proteínas a lo largo del tiempo (Figura 2). También podrían incorporarse técnicas alternativas como el dicroísmo circular (CD) o la calorimetría diferencial de barrido (DSC). Además, la incorporación de lípidos en etapas específicas es esencial para maximizar tanto la actividad como la cristalogénesis del ABCG5/G8 purificado. Por ejemplo, el colato y el CHS son necesarios para exhibir hidrólisis medible de ATP; los fosfolípidos son indispensables para mantener la estabilidad de las proteínas metiladas; y el colesterol es un componente necesario de la solución de bicelle, que fomenta el crecimiento de cristales adecuados para la difracción de rayos X de alta resolución (Figura 4).
En esencia, todo el procedimiento se puede lograr en una semana de esfuerzo. A diferencia del LCP, la recuperación de cristales de las bandejas de cristalización de gotas colgantes es sencilla. De cara al futuro, con un rendimiento proteico sustancial (aproximadamente 10 mg), este protocolo es fácilmente adaptable para el desarrollo de investigaciones cristalográficas que involucren mutantes ABCG5/G8 u otras proteínas transportadoras. Esto es particularmente pertinente para los casos que actualmente evaden la visualización a través de la microscopía electrónica.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo cuenta con el apoyo de una Beca de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (RGPIN 2018-04070) y una Beca de Proyecto de Investigación de los Institutos Canadienses de Salud (PJT-180640) para JYL. Este protocolo se basa en los reportes originales en estructuras cristalinas ABCG5/G8 reportados anteriormente por Farhat et al.22 y Lee et al.23.
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |