脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

1. クローニングとタンパク質発現 ヒトABCG5/G8遺伝子を以前のプロトコルに従ってピキア・パストリス酵母にクローニングする25,26。簡単に説明すると、pPICZBからpSGP18およびpLIC発現ベクターを誘導します。ライノウイルスの3Cプロテアーゼ部位とそれに続くカルモジュリン結合ペプチド(CBP)をコードするタグをABCG8 cDNA(pSGP18-G8-3C-CBP)のC末端に追加します。グリシン(His 6 GlyHis 6)で区切られた6-ヒスチジンタグをABCG5 cDNA(pLIC-G5-H12)のC末端に添加します。エレクトロポレーションを用いてプラスミドをピキア株KM71Hに共形質転換します。注:使用したプラスミド、培地、バッファーの詳細については、 材料表 を参照してください。 形質転換酵母細胞をMD寒天プレート上で28°Cで増殖させます。 1〜2日後、10〜12個のコロニーを選択し、小規模培養用の50 mL遠心チューブを使用して、10 mLの最小グリセロール酵母窒素塩基(MGY)培地に接種します。遠心分離管の蓋に3つの小さな穴を開けて、通気性を高めます。600 nm(OD600)での光学濃度が10に達するまで、250 rpmで一定に振とうしながら、28°Cで細胞を増殖させます。注:細胞増殖には通常12〜24時間かかります。 翌日、1 Lの滅菌MGY培地を採取し、2.4 Lフラスコで初代培養液を接種します。フラスコを28°Cのシェーカーインキュベーターで250rpmで24時間インキュベートします。pHを5〜6に維持するには、pHが安定するまで10%水酸化アンモニウム(NH4OH)を追加します。 培養液 1 L あたり 1 mL の純メタノール(0.1 %(v/v)メタノール)を添加して、pH を調整し、タンパク質発現を誘導します。注:その後、培養液1リットルあたり5 mLの純粋なメタノール(0.5%(v / v)メタノール)を12時間ごとに合計36〜48時間細胞に供給します。 15,000 x g で4°Cで30分間遠心分離して細胞を回収します。 細胞ペレットを回収し、溶解緩衝液(0.33 M スクロース、0.3 M Tris-Cl pH 7.5、0.1 M アミノヘキサン酸、1 mM EDTA、および1 mM EGTA)に0.5 g/mLの濃度で再懸濁します。懸濁液は-80°Cで保管してください。 典型的には、1Lの培養細胞から30±5gの細胞塊を回収することができる。注:細胞ペレットは冷凍庫に直接保存するか、メンブレン調製用の溶解バッファーに直ちに再懸濁してください。 2. ミクロソーム膜の作製 細胞を融解し、プロテアーゼ阻害剤(ロイペプチン 2 μg/mL、ペプスタチン A2 μg/mL、PMSF 2 mM、 材料表を参照)を添加します。細胞をさらに溶解するには、25,000〜30,000psiで氷冷乳化剤またはマイクロフルイダイザー( 材料表を参照)を使用します。このプロセスを3〜4回繰り返します。 細胞破片を除去するための遠心分離機:3,500-4,000 x gで15分間スピンし、続いて15,000 x gで30分間2回目のスピンを行います。両方のスピンを4°Cに維持します。 ミクロソーム膜小胞を単離するには、上清を超遠心チューブに移し、2,00,000 x g で4°Cで1.5時間超遠心分離します。メンブレンペレットを50 mLのバッファーA(50 mM Tris-Cl pH 8.0、100 mM NaCl、10%グリセロール)にダンスホモジナイザーを使用して再懸濁します。懸濁液は-80°Cで保管してください。 3. 蛋白質調製 – ヘテロ二量体の精製 凍結したミクロソーム膜を融解し、可溶化緩衝液を用いて濃度を4-6 mg/mLに調整します。バッファーには、50 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl、10% グリセロール、1% (w/v) β-ドデシルマルトシド(β-DDM)、0.5% (w/v)コール酸、0.1 %(w/v)コレステリルヘミコハク酸(CHS)、5 mM イミダゾール、5 mM β-メルカプトエタノール(β-ME)、2 μg/mL ロイペプチン、2 μg/mL ペプスタチン A、2 mM PMSF が含まれている必要があります( 材料表を参照)。注:同量のメンブレン調製物と可溶化バッファーを混合するか、プロテアーゼ阻害剤および還元剤を含まない2倍の可溶化バッファーを使用できます。緩衝液の沸騰を短くすることで、CHSを効率的に溶解することができます。精製には、4°Cで冷却した緩衝液のみを使用してください。混合物を中速で4°Cで1時間撹拌します。 これに続いて、室温(RT)で20〜30分間さらに攪拌します。 混合物を1,00,000 x g で4°Cで30分間遠心分離し、不溶性メンブレンを除去します。可溶化上清を回収し、20 mM イミダゾールと 0.1 mM TCEP を添加します。 アフィニティーカラムクロマトグラフィー26:可溶化した上清をバッファーA(ステップ2.2.1)中で平衡化したNi-NTAビーズ(10〜15mL)( 材料表を参照)に一晩結合します。注:これ以降は、泳動バッファーにグリセロールを使用することは避けてください。25 mM イミダゾールを含む 10 カラム容量のバッファー B (50 mM HEPES、pH 7.5、100 mM NaCl、0.1 % (w/v) β-DDM、0.05 % (w/v) コール酸塩、0.01 % (w/v) CHS、0.1 mM TCEP) でカラムを 2 回洗浄します。 50 mM イミダゾールを含むバッファー B の 10 カラム容量でカラムを洗浄します。 バッファー C(バッファー B、200 mM イミダゾールを含む)を使用してタンパク質を溶出します。 溶出したタンパク質に 1 mM TCEP( 材料表を参照)と 10 mM MgCl2 を添加します。 SDS-PAGEゲルで溶出したフラクションを検証し、正しいタンパク質サイズ26を確認します。注:典型的なタンパク質収量(1st Ni-NTA):6 L培養あたり10〜20 mgのタンパク質。DDMは臨界ミセル濃度(CMC)の10倍または5倍(約0.01%)で使用してください。このプロトコルは0.1Mを採用しています。 Ni-NTA 溶出からのピークフラクションを等量のバッファー D1(バッファー B と 1 mM CaCl 2、1 mM MgCl2)で希釈し、混合し、CBP 洗浄バッファー D1 で事前に平衡化した CBP カラム(3-5 mL)(材料表を参照)にタンパク質フラクションをロードします。 バッファー D1 および D2(バッファー B、1 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、0.1% (w/v) デシルマルトースネオペンチルグリコール(DMNG)、β-DDM なし)を含むバッファー B)を使用して界面活性剤を交換するために、CBP カラムで連続洗浄を行います。次に、D1:D2(3:1、v/v)の 3 カラム容量で洗浄します。第三に、D1:D2(1:1、v/v)の 3 カラム容量で洗浄します。4 番目のステップでは、3 カラム容量の D1:D2(1:3、v/v)で洗浄し、続いて 6-10 カラム容量の D2 で洗浄します。 CBP カラムから 300 mM NaCl を 1 mL フラクションで CBP 洗浄バッファー D2 (合計 10 mL) に溶出します。溶出した画分を1〜2 mLに濃縮します。注:典型的なタンパク質収量(1st CBP)は、6 L培養あたり5〜15 mgのタンパク質です。マルトースネオペンチルグリコール(MNG)界面活性剤は、4°Cでの精製タンパク質の貯蔵を強化します。 DMNGとLauryl MNG(LMNG)の両方が使用され、DMNGの方が優れたX線回折結晶が得られました。DMNGは臨界ミセル濃度(CMC)の10〜20倍、約0.003%で使用してください。このプロトコルでは、0.1%のDMNGを使用しました。CBP溶出液の一部分は、ゲルろ過クロマトグラフィー(ステップ4.4)によってさらに精製され、タンパク質のATPase活性を分析したり、透過型電子顕微鏡(TEM)で単分散性を評価したりできます。 4. 蛋白質の準備前結晶化の処置 エンドグリコシダーゼH(Endo H、精製タンパク質10-15 mgあたり~0.2 mg)およびHRV-3Cプロテアーゼ(精製タンパク質10-15 mgあたり~2 mg)を用いて、N-結合型糖鎖およびCBPタグをそれぞれ切断します( 材料表を参照)。4°Cで一晩インキュベートします。 Endo Hおよび3Cプロテアーゼのインキュベーション中に、プールされたタンパク質に対して還元的アルキル化を行います。まず、20 mM ヨードアセトアミド( 材料表を参照)と 4 °C で一晩インキュベートします。 これに続いて、氷上でさらに2 mMヨードアセトアミドと1時間のインキュベーションを行います。注:このステップにより、タンパク質の保存が4°Cで最大1か月間さらに安定化します。 2本目のCBPカラム(1〜2 mL)を使用して、切断したCBPタグを分離します。このプロセスにはバッファー D2 を使用します。注:典型的なタンパク質収量(2nd CBP)は、6 L培養あたり5〜10 mgのタンパク質です。 CBPタグフリータンパク質をゲルろ過クロマトグラフィーで精製します。バッファーには、10 mM HEPES、pH 7.5、100 mM NaCl、0.1%(w/v)DMNG、0.05%(w/v)コール酸、および0.01%(w/v)CHSが含まれている必要があります。注:典型的なタンパク質収量(ゲルろ過)は、6 L培養あたり2〜8 mgのタンパク質です。このステップでは、ゲルろ過中にDDMピーク(~65 kD)が見られないことから、DMNGへの界面活性剤交換が成功したことを示します。 還元的メチル化によりプールされたタンパク質画分を修飾します:20 mMのジメチルアミンボラン(DMAB、 材料表を参照)と40 mMのホルムアルデヒドをタンパク質に添加します。振動式シェーカーで4°Cで2時間インキュベートします。10 mM DMAB を添加します。10 mM DMABの添加を含むステップ4.5を繰り返し、4°Cで一晩(12〜18時間)インキュベートします。 100 mM Tris-Cl、pH 7.5 を添加して反応を停止します。 メチル化タンパク質を、100 mM Tris-Cl、pH 8.0、100 mM NaCl で平衡化した 2 mL の Ni-NTA カラムにロードします。10 カラム容量の洗浄バッファー(10 mM HEPES、pH 7.5、100 mM NaCl、0.5 mg/mL DOPC:DOPE (3:1、w/w)、0.1% (w/v) DMNG、0.05% (w/v) コール酸、0.01% (w/v) CHS)を使用してカラムを洗浄します。 溶出バッファー(10 mM HEPES、pH 7.5、100 mM NaCl、200 mM イミダゾール、0.5 mg/mL DOPC:DOPE (1:1、w/w)、0.1%(w/v)DMNG、0.05%(w/v)コール酸、0.01%(w/v)CHS)を使用して、再活性化したタンパク質を溶出します。注:典型的なタンパク質収量(2nd Ni-NTA)は、培養液6 Lあたり1〜5 mgのタンパク質です。 タンパク質溶出液を、ステップ4.4で使用したバッファーと事前に平衡化したPD-10脱塩カラムに通します。 脱塩して再塩化したタンパク質をコレステロール(イソプロパノールまたはエタノールで調製)と一晩インキュベートし、最終濃度が~20 μMになるまでインキュベートします。翌朝、4°Cで10分間、1,50,000 x g で超遠心分離することにより沈殿物を除去します。 上澄み液を採取します。 100 kDaカットオフ遠心濃縮器を使用して、タンパク質を最終濃度30〜50 mg/mLまで濃縮します。 卓上型冷蔵遠心分離機を使用して、4°Cで30分間、最高速度で沈殿剤を除去します。 上清を氷上4°Cに保ち、バイセルの結晶化条件を確立します。注:濃縮タンパク質は、1週間以内に結晶成長に使用する必要があります。タンパク質を凍結しないでください。 5. バイセルにおけるタンパク質の結晶化 DMPC 脂質と CHAPSO 界面活性剤を 3:1(w/w)の比率で 10% ビセル原液を調製します( 材料表を参照)。注:CHAPSO は臨界ミセル濃度(CMC)の 5 倍(約 0.5%)で使用してください。これにより、タンパク質-バイセル混合物中のCMC周辺の界面活性剤濃度が維持されます(ステップ5.2)。脱イオン化H2O溶解界面活性剤(CHAPSO)を予備乾燥脂質(5モル%コレステロールと95モル%DMPCの混合物)に加えます。注:クロロホルムでさまざまな脂質組成物を調製し、室温で窒素ガス流を使用してガラス試験管内で乾燥させます。 残留溶媒を真空チャンバーに一晩置き、薄い脂質層を形成して除去します。 水浴超音波処理装置を使用して脂質と界面活性剤を再懸濁します。 溶液が透明になるまで、連続的な電力を使用して氷冷水でバイセル混合物を超音波処理します。注意: 聴覚保護具を使用し、混合物を液相に保つために十分な氷の供給を確保してください。 0.2 μmの遠心フィルターで未溶解成分を除去します( 材料表を参照)。注:分注したバイセル溶液は-80°Cで保管してください。 10%のバイセル(ステップ5.1.4)とタンパク質(ステップ4.7.4)を1:4(v/v)の比率で穏やかに混合し、最終的なタンパク質濃度を5〜10 mg/mLにすることで、氷上でタンパク質/ビセル混合物を作成します。 タンパク質とバイセルの混合物を氷上で30分間インキュベートします。 48ウェルプレートを用いた吊り下げ滴下蒸気拡散フォーマットで結晶化条件を設定します。等量(0.5または1 μL)のタンパク質/ビセル混合物と、1.6 M-2.0 Mの硫酸アンモニウム、100 mM MES(pH 6.5)、0%-4% PEG 400、および1 mM TCEPを含む結晶化リザーバー溶液を混合します( 材料表を参照)。注:各実験の前に、硫酸アンモニウム(1.6〜2.0 M)およびPEG 400(0%〜4%)を調整して、リザーバー溶液のマトリックスを作成します。 20°Cで結晶化するためにインキュベートします。 翌日、結晶化トレイをチェックして、カバーガラスが適切に密閉されていることを確認します。 少なくとも1日1回は結晶の成長を監視します。高品質の結晶は通常1〜2週間以内に現れ、50〜150μm x 20〜50μm x 2〜5μmを測定します。注:結晶は、タンパク質濃度が低いと形成に時間がかかる場合があります。成熟した結晶は1ヶ月以内に収穫する必要があります。 タンパク質結晶を0.2 Mのマロン酸ナトリウムに浸し、50 μmまたは100 μmのクライオループを使用して液体窒素中で急速凍結します。注:X線回折計が利用可能な場合は、15〜30分のX線ビーム照射でいくつかの結晶をテストして、最大5 Åの回折を明らかにします。より高分解能の回折には、シンクロトロン光源が必要です。0.2 Mのマロン酸ナトリウムを凍結保護剤として使用すると、100 μm x 50 μm x 2 μmの結晶で、放射光X線で約90の回折像フレームを提供できます。