ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie

1. Klonen en eiwitexpressie Kloon het menselijke ABCG5/G8-gen in Pichia pastoris-gist volgens eerdere protocollen25,26. Leid in het kort pSGP18- en pLIC-expressievectoren af van pPICZB. Voeg een tag toe die codeert voor een rhinovirus 3C-proteaseplaats gevolgd door een calmodulinebindend peptide (CBP) aan de C-terminus van ABCG8 cDNA (pSGP18-G8-3C-CBP).Voeg een zes-histidine-tag gescheiden door een glycine(His 6 GlyHis6) toe aan de C-terminus van ABCG5 cDNA (pLIC-G5-H12). Co-transformeer de plasmiden in Pichia-stam KM71H met behulp van elektroporatie.OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor de details van de gebruikte plasmiden, media en buffers. Kweek getransformeerde gistcellen op MD-agarplaten bij 28 °C. Selecteer na 1-2 dagen 10-12 kolonies en inoculeer ze in 10 ml minimale glycerolgiststikstofbasis (MGY) media met behulp van centrifugebuisjes van 50 ml voor kleinschalige kweek.Maak drie kleine gaatjes in het deksel van de centrifugebuis voor een betere beluchting. Laat cellen groeien bij 28 °C met constant schudden bij 250 tpm totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) 10 bereikt, meestal 1-2 nachten.OPMERKING: Celgroei duurt meestal tussen de 12-24 uur. Neem de volgende dag 1 l steriele MGY-media en inoculeer deze met de primaire cultuur in een kolf van 2,4 l. Incubeer de kolf bij 28 °C in een schudincubator bij 250 omw/min gedurende 24 uur.Om de pH tussen 5-6 te houden, voegt u 10% ammoniumhydroxide (NH4OH) toe totdat de pH stabiliseert. Pas de pH aan en induceer eiwitexpressie door 1 ml pure methanol per 1 L-cultuur (0,1% (v/v) methanol) toe te voegen.OPMERKING: Voer de cellen vervolgens elke 12 uur met 5 ml pure methanol per liter cultuur (0,5 % (v/v) methanol) gedurende een totale duur van 36-48 uur. Oogst de cellen door te centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Verzamel celpellets en resuspendeer ze in lysisbuffer (0,33 M sucrose, 0,3 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M aminohexaanzuur, 1 mM EDTA en 1 mM EGTA) tot een concentratie van 0,5 g/ml. Bewaar de suspensie bij -80 °C. Doorgaans kan men 30 ± 5 g celmassa terugwinnen uit 1 L gekweekte cellen.OPMERKING: Bewaar celpellets direct in de vriezer of voer onmiddellijke resuspensie uit in lysisbuffer voor membraanpreparaten. 2. Voorbereiding van microsomaal membraan Ontdooi de cellen en voeg proteaseremmers toe (2 μg/ml leupeptine, 2 μg/ml pepstatine A, 2 mM PMSF, zie materiaaltabel).Om cellen verder te lyseren, gebruikt u een ijsgekoelde emulgator of microfluïdizer (zie Materiaaltabel) bij 25.000-30.000 psi. Herhaal dit proces 3-4 keer. Centrifuge om celresten te verwijderen: centrifugeer op 3.500-4.000 x g gedurende 15 minuten, gevolgd door een tweede centrifuge op 15.000 x g gedurende 30 min. Houd beide centrifuges op 4 °C. Om microsomale membraanblaasjes te isoleren, brengt u het supernatans over in ultracentrifugebuisjes en onderwerpt u het gedurende 1,5 uur bij 4 °C aan ultracentrifugatie bij 2,00.000 x g .Resuspendeer de membraanpellet in 50 ml Buffer A (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM NaCl en 10% glycerol) met behulp van een dounce-homogenisator. Bewaar de suspensie bij -80 °C. 3. Eiwitbereiding – zuivering van heterodimeren Ontdooi de bevroren microsomale membranen en pas de concentratie aan tot 4-6 mg/ml met behulp van een oplosbare buffer. De buffer moet 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glycerol, 1% (m/v) β-dodecylmaltoside (β-DDM), 0,5% (m/v) cholaat, 0,1% (m/v) cholesterylhemisuccinaat (CHS), 5 mM imidazool, 5 mM β-mercaptoethanol (β-ME), 2 μg/ml leupeptine, 2 μg/ml pepstatine A en 2 mM PMSF bevatten (zie materiaaltabel).OPMERKING: Men kan gelijke volumes van het membraanpreparaat en de oplosbaarheidsbuffer mengen, of 2x oplosbaarheidsbuffer gebruiken zonder proteaseremmers en reductiemiddelen. Kort koken van de buffer helpt CHS efficiënt op te lossen. Gebruik voor de zuivering alleen de 4 °C-gekoelde buffer.Roer het mengsel op gemiddelde snelheid gedurende 1 uur bij 4 °C. Volg dit met extra roeren op kamertemperatuur (RT) gedurende 20-30 minuten. Centrifugeer het mengsel bij 1,00,000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om onoplosbare membranen te verwijderen. Vang het opgeloste supernatans op en voeg 20 mM imidazol en 0,1 mM TCEP toe. Voer affiniteitskolomchromatografie26 uit: bind het opgeloste supernatans ‘s nachts aan vooraf gebalanceerde Ni-NTA-korrels (10-15 ml) (zie materiaaltabel) in buffer A (stap 2.2.1).OPMERKING: Vermijd vanaf dit punt het gebruik van glycerol in lopende buffers.Was de kolom tweemaal met 10 kolomvolumes buffer B (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % (m/v) β-DDM, 0,05 % (m/v) cholaat, 0,01 % (m/v) CHS, 0,1 mM TCEP) met 25 mM imidazool. Was de kolom met 10 kolomvolumes buffer B met 50 mM imidazool. Elueer het eiwit met behulp van buffer C (buffer B met 200 mM imidazool). Voeg 1 mM TCEP (zie materiaaltabel) en 10 mM MgCl2 toe aan de geëlueerde eiwitten. Valideer de geëlueerde fracties op een SDS-PAGE-gel om de juiste eiwitgrootte26 te bevestigen.OPMERKING: Typische eiwitopbrengst (1st Ni-NTA): 10-20 mg eiwit per 6 L cultuur. Gebruik DDM in een dosis van 10x of 5x van de kritische micelconcentratie (CMC), ongeveer 0,01%. Dit protocol maakt gebruik van 0,1% DDM. Verdun de piekfracties van Ni-NTA-elutie met een gelijk volume buffer D1 (buffer B met 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2), meng en laad de eiwitfracties op een CBP-kolom (3-5 ml) (zie materiaaltabel) die vooraf is geëgaliseerd met CBP-wasbuffer D1. Voer opeenvolgende wasbeurten uit op de CBP-kolom om wasmiddelen uit te wisselen met behulp van buffer D1 en D2 (buffer B met 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 0,1% (m/v) decylmaltose-neopentylglycol (DMNG), zonder β-DDM): eerst wassen met 3 kolomvolumes D1; ten tweede, wassen met 3 kolomvolumes van D1:D2 (3:1, v/v); ten derde, wassen met 3 kolomvolumes D1:D2 (1:1, v/v); vierde stap, wassen met 3 kolomvolumes van D1:D2 (1:3, v/v), gevolgd door 6-10 kolomvolumes van D2. Elueer het eiwit met behulp van CBP wash Buffer D2 met 300 mM NaCl in fracties van 1 ml uit de CBP-kolom (totaal 10 ml). Concentreer de geëlueerde fracties tot 1-2 ml.OPMERKING: De typische eiwitopbrengst (1eCBP ) is 5-15 mg eiwit per 6 L-cultuur. Maltose neopentylglycol (MNG) reinigingsmiddelen verbeteren de opslag van gezuiverde eiwitten bij 4 °C. Zowel DMNG als Lauryl MNG (LMNG) werden gebruikt, waarbij DMNG betere röntgendiffracterende kristallen opleverde. Gebruik DMNG in een dosis van 10-20x de kritische micelconcentratie (CMC), ongeveer 0,003%. Dit protocol gebruikte 0,1% DMNG. Een fractie van het CBP-eluaat kan verder worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie (stap 4.4.) om de ATPase-activiteit van eiwitten te analyseren of de monodispersiteit te beoordelen door middel van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). 4. Eiwitbereiding-pre-kristallisatiebehandeling Splits de N-gebonden glycanen en CBP-tags met respectievelijk endoglycosidase H (Endo H, ~0,2 mg per 10-15 mg gezuiverd eiwit) en HRV-3C-protease (~2 mg per 10-15 mg gezuiverd eiwit) (zie Tabel met materialen). Incubeer een nacht bij 4 °C. Voer tijdens de incubatie van Endo H- en 3C-protease reductieve alkylering uit op de gepoolde eiwitten. Begin met incubatie met 20 mM jodoacetamide (zie materiaaltabel) gedurende een nacht bij 4 °C. Volg dit met een incubatie van 1 uur met nog eens 2 mM jodoacetamide op ijs.OPMERKING: Deze stap stabiliseert de eiwitopslag verder gedurende maximaal een maand bij 4 °C. Gebruik een tweede CBP-kolom (1-2 ml) om de gespleten CBP-tag te scheiden. Gebruik hiervoor Buffer D2.OPMERKING: De typische eiwitopbrengst (2eCBP ) is 5-10 mg eiwit per 6 L-cultuur. Zuiver het CBP-tagvrije eiwit met behulp van gelfiltratiechromatografie. De buffer moet 10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% (m/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholaat en 0,01% (w/v) CHS bevatten.OPMERKING: De typische eiwitopbrengst (gelfiltratie) is 2-8 mg eiwit per 6 L-cultuur. Tijdens deze stap duidt de afwezigheid van een DDM-piek (~65 kD) tijdens gelfiltratie op een succesvolle uitwisseling van reinigingsmiddel naar DMNG. Wijzig de gepoolde eiwitfracties door reductieve methylering: voeg 20 mM dimethylamineboor (DMAB, zie Materiaaltabel) en 40 mM formaldehyde toe aan het eiwit. Incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C op een oscillerende schudder. Voeg 10 mM DMAB toe.Herhaal stap 4.5, inclusief de toevoeging van 10 mM DMAB, en incubeer ‘s nachts (12-18 uur) bij 4 °C. Stop de reactie door 100 mM Tris-Cl, pH 7,5 toe te voegen. Laad het gemethyleerde eiwit op een Ni-NTA-kolom van 2 ml die vooraf is gebalanceerd met 100 mM Tris-Cl, pH 8.0 en 100 mM NaCl.Was de kolom met 10 kolomvolumes wasbuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, met 0,5 mg/ml DOPC: DOPE (3:1, w/w), 0,1% (w/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholaat, 0,01% (w/v) CHS). Elute het gerelipideerde eiwit met behulp van elutiebuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 200 mM imidazool, 0,5 mg/ml DOPC: DOPE (1:1, w/w), 0,1% (w/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholaat, 0,01% (w/v) CHS).OPMERKING: De typische eiwitopbrengst (2nd Ni-NTA) is 1-5 mg eiwit per 6 L-cultuur. Haal het eiwit eluaten door een PD-10 ontziltingskolom die vooraf in evenwicht is gebracht met de buffer die in stap 4.4 is gebruikt. Incubeer het ontzoute en gerelipideerde eiwit ‘s nachts met cholesterol (bereid in isopropanol of ethanol) tot een eindconcentratie van ~20 μM.Verwijder de volgende ochtend het neerslagmiddel door middel van ultracentrifugatie bij 1,50,000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel de supernatant. Concentreer het eiwit tot een eindconcentratie van 30-50 mg/ml met behulp van een centrifugaalconcentrator met een 100 kDa cutoff-centrifugaalconcentrator. Verwijder het neerslagmiddel met behulp van een gekoelde tafelcentrifuge op topsnelheid gedurende 30 minuten bij 4 °C. Houd het supernatans op ijs bij 4 °C en breng kristallisatiecondities in de bicelles tot stand.OPMERKING: De geconcentreerde eiwitten moeten binnen een week worden gebruikt voor kristalgroei. Vries de eiwitten niet in. 5. Eiwitkristallisatie in bicellen Bereid een 10% bicelle-stockoplossing met DMPC-lipiden en CHAPSO-wasmiddel in een verhouding van 3:1 (w/w) (zie materiaaltabel).OPMERKING: Gebruik CHAPSO bij 5x de kritische micelconcentratie (CMC), ongeveer 0,5%. Hierdoor blijft de concentratie van het wasmiddel rond de CMC in het eiwit-bicellemengsel behouden (stap 5.2).Voeg gedeïoniseerd H2O-opgelost wasmiddel (CHAPSO) toe aan voorgedroogde lipiden (mengsel van 5 mol% cholesterol en 95 mol% DMPC).OPMERKING: Bereid verschillende lipidesamenstellingen in chloroform en droog ze in een glazen reageerbuis met behulp van een stikstofgasstroom bij RT. Verwijder resterende oplosmiddelen door ze een nacht in een vacuümkamer te plaatsen en een dunne lipidenlaag te vormen. Resuspendeer lipiden en wasmiddel met behulp van een waterbadsonicator. Sonificeer het bicellemengsel in ijsgekoeld water met continu vermogen totdat de oplossing transparant wordt.NOTITIE: Gebruik gehoorbescherming en zorg voor voldoende ijstoevoer om het mengsel in een vloeibare fase te houden. Verwijder onopgeloste componenten met een centrifugaalfilter van 0,2 μm (zie Materiaaltabel).OPMERKING: Bewaar de gealiquoteerde bicelle-oplossing bij -80 °C. Maak een eiwit/bicelle-mengsel op ijs door voorzichtig 10% bicelles (stap 5.1.4) en eiwitten (stap 4.7.4) te combineren in een verhouding van 1:4 (v/v), waardoor een uiteindelijke eiwitconcentratie tussen 5-10 mg/ml wordt bereikt. Incubeer het eiwit- en bicellemengsel gedurende 30 minuten op ijs. Stel kristallisatiecondities in een hangend druppeldampdiffusieformaat in met behulp van platen met 48 putjes.Meng gelijke volumes (0,5 of 1 μL) eiwit/bicellemengsel en kristallisatiereservoiroplossing met 1,6 M-2,0 M ammoniumsulfaat, 100 mM MES (pH 6,5), 0%-4% PEG 400 en 1 mM TCEP (zie Materiaaltabel).OPMERKING: Maak voorafgaand aan elk experiment een matrix van de reservoiroplossing, waarbij ammoniumsulfaat (1,6-2,0 M) en PEG 400 (0%-4%) worden aangepast. Incubeer voor kristallisatie bij 20 °C. Controleer de kristallisatietrays de volgende dag om er zeker van te zijn dat het afdekglas goed is afgesloten. Controleer de kristalgroei minstens één keer per dag. Kristallen van hoge kwaliteit verschijnen meestal binnen 1-2 weken, met afmetingen van 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm.OPMERKING: Bij lagere eiwitconcentraties kan het langer duren voordat kristallen zich vormen. Rijpe kristallen moeten binnen een maand worden geoogst. Week eiwitkristallen in 0,2 M natriummalonaat en vries ze snel in vloeibare stikstof in met behulp van cryolussen van 50 of 100 μm.OPMERKING: Als er een röntgendiffractometer beschikbaar is, test dan een paar kristallen met een blootstelling van 15-30 minuten aan de röntgenstraal om diffractie tot 5 Å aan het licht te brengen. Diffractie met een hogere resolutie vereist een synchrotronlichtbron. Met behulp van 0,2 M natriummalonaat als cryo-protectant kan een kristal van 100 μm x 50 μm x 2 μm ongeveer 90 diffractiebeeldframes leveren met synchrotron-röntgenstraling.