ABCG5 / G8 التبلور في بيئة ثنائية الخلية الدهنية لعلم البلورات بالأشعة السينية
Summary
يصف هذا البروتوكول إعدادا لتبلور ناقل الستيرول ABCG5 / G8. يتم إعادة تشكيل ABCG5 / G8 إلى ثنائيات للتبلور المعلق والقطرة. لا يتطلب البروتوكول مواد أو ركائز متخصصة ، مما يجعله متاحا وسهل التكيف في أي مختبر لتحديد بنية البروتين من خلال علم البلورات بالأشعة السينية.
Abstract
تشكل ناقلات الكاسيت المرتبط ب ATP (ABC) بروتينات غشائية مدمجة في الدهون. عادة ما يتم استخراج هذه البروتينات الغشائية من طبقة الدهون المزدوجة إلى بيئة مائية عن طريق استخدام المنظفات. تعمل هذه المنظفات على تفكيك طبقة الدهون المزدوجة وإذابة البروتينات. يشكل الموائل الجوهرية للبروتينات الغشائية داخل الطبقة الثنائية الدهنية تحديا في الحفاظ على استقرارها وتوحيدها في محلول التوصيف الهيكلي. Bicelles ، التي تتكون من مزيج من الدهون الفوسفاتية طويلة وقصيرة السلسلة والمنظفات ، تكرر بنية الدهون الطبيعية. يعمل استخدام bicelles الدهنية والمنظفات كنظام نموذجي مناسب للحصول على بلورات حيود عالية الجودة ، وتحديدا لتحديد البنية عالية الدقة لبروتينات الغشاء. من خلال هذه البيئات الدقيقة الاصطناعية ، تحافظ البروتينات الغشائية على شكلها ووظائفها الأصلية ، مما يسهل تكوين بلورات ثلاثية الأبعاد. في هذا النهج ، تم إعادة دمج ABCG5 / G8 غير المتجانس القابل للذوبان في المنظفات في ثنائي DMPC / CHAPSO ، مع استكمال الكوليسترول. تم استخدام هذا الإعداد في الإجراء التجريبي لنشر البخار لبلورة البروتين.
Introduction
تشكل ناقلات الكاسيت المرتبط ب ATP (ABC) عائلة فائقة من البروتينات الغشائية المسؤولة عن عمليات النقل المتنوعة المعتمدة على ATP عبر الأغشية البيولوجية1،2،3،4،5. هذه البروتينات الناقلة متورطة في أمراض القلب والأوعية الدموية وتلعب دورا مهما في تسهيل تدفق الكوليسترول إلى الصفراء لإفرازه لاحقا في الكبد. وبالتالي ، حظي استقلاب الكوليسترول والتوازن باهتمام كبير على مر السنين6. تتضمن آلية محددة تشارك في التخلص من الكوليسترول والستيرول الآخر من الجسم أعضاء من فصيلة ABCG البشرية ، ولا سيما ABCG5 / G8 غير المتجانسة7،8،9،10. تؤدي الطفرات في أي من هذه الجينات إلى تعطيل المغاير ، مما يؤدي إلى فقدان الوظيفة والتسبب في سيتوستيروليميا ، وهو اضطراب يؤثر على الاتجار بستيرول11،12،13. نظرا لأهمية المرض ودوره في تعزيز تدفق الكوليسترول ، جذبت ناقلات الستيرول اهتماما كبيرا. ومع ذلك ، فإن التفاصيل المعقدة لآليتها الجزيئية وانتقائية الركيزة لا تزال غير معلنة إلى حد كبير. وبالتالي ، فإن توضيح البنية البلورية ل ABCG5 / G8 هو خطوة حاسمة نحو فهم الآليات ووظائف المصب في نقل الكوليسترول.
تتطلب البروتينات الغشائية التثبيت داخل الأغشية لتطوى وتعمل بشكل صحيح. وبالتالي ، فإن استخراج البروتينات الغشائية من بيئتها الطبيعية غالبا ما يؤدي إلى عدم استقرار البروتين ، واختلال طيه ، وفقدان الوظيفة14,15. تؤكد هذه التحديات على العقبات الأساسية التي تواجه تبلور البروتين الغشائي. ومع ذلك ، فإن إعادة تكوين البروتينات إلى طبقات ثنائية من المنظفات الاصطناعية ، مثل bicelles ، قد ظهرت كحل لهذا المأزق ، مما يتيح الحفاظ على بروتينات الغشاء داخل بيئة ثنائية الطبقة تشبه السكانالأصليين 16. Bicelles عبارة عن مجموعات من الدهون الفوسفاتية الاصطناعية والمنظفات المعلقة والقابلة للذوبان في الماء. والجدير بالذكر أنهم يتبنون بنية ثنائية الطبقة تحاكي الأغشية البيولوجية16،17،18. يمكن أن تنتقل Bicelles بين المراحل السائلة والجل بناء على درجة الحرارة واللزوجة. يستفيد تبلور Bicelle من الأقراص ثنائية الطبقة الصغيرة واللزوجة المنخفضة في درجات حرارة منخفضة ، مما يسهل الخلط الشامل للبروتينات والمحاليل ثنائية السيل. يعتمد حجم البيسيلات على نسبة المنظفات إلى الدهون أثناء التحضير19,20. تشمل المنظفات السائدة لتكوين ثنائي الخلية 3- [(3-كولاميدو بروبيل) ثنائي ميثيل أمونيو] -2-هيدروكسي-1-بروبان سلفونات (CHAPSO) ، جنبا إلى جنب مع 3- [(3-كولاميدو بروبيل) ثنائي ميثيل أمونيو] -1-بروبان سلفونات (CHAPS) و 1،2-ديتريديكانويل-sn-جلسرينول-3-فوسفوكولين (DHPC) 21. تستخدم هذه المنظفات جنبا إلى جنب مع الدهون مثل دي ميريستويل-فوسفاتيديل كولين (DMPC) و 1-بالميتويل-2-أوليويل-فوسفاتيديل كولين (POPC). علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات الحديثة الوظائف الكاملة للبروتينات الغشائية داخل bicelles في ظل الظروف الفسيولوجية. على سبيل المثال ، نجح لي وزملاؤه في بلورة البنية البلورية ل ABCG5 / ABCG8 والإبلاغ عنها بناء على طبقة ثنائية دهنية22,23. في عملية التبلور ، يمكن استيعاب مخاليط البروتين ثنائي الخلية باستخدام المعدات القياسية ، بما في ذلك روبوتات التبلور عالية الإنتاجية24. ومع ذلك ، فإن جدوى استخدام bicelles تتوقف على الثبات الحراري للبروتينات بسبب ظروف التبلور في درجات حرارة أعلى. ومع ذلك ، عند مقارنتها بالتقنيات الأخرى ، تظل ظروف التبلور المطلوبة للبروتينات الغشائية خفيفة بشكل عام ، بما في ذلك تركيزات منخفضة من المادة المرسبة والملح والعازلة. وهذا يجعل كلا من مخاليط البروتين ثنائي الخلية ونشر البخار أدوات فعالة وسهلة التنفيذ للدراسات الهيكلية للبروتينات الغشائية.
يحدد هذا البروتوكول الخطوات الأساسية في تحضير البروتين وتبلور ثنائي الخلية لتحديد البنية البلورية للأشعة السينية ل ABCG5 / G8 بدقة عالية (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
دفعت التحديات المرتبطة بتبلور البروتينات الغشائية إلى تطوير طرق التبلور المدفوع بطبقة الدهون ، مثل نهج bicelle27 أو الطور التكعيبي الدهني (LCP) 14 . ومع ذلك ، فإن تحقيق التبلور الناجح للبروتينات الغشائية لا يزال يتوقف على الخطوة الحرجة وأحيانا الاختناق لإعداد البروتين. والجدير بالذكر أن ناقلات ABC تمثل عقبة هائلة في زراعة البلورات المناسبة لعلم البلورات بالأشعة السينية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات عملية شاملة لتبسيط تحضير ناقل ستيرول ABCG5 / G8 البشري وتعزيز نمو البلورات من خلال نهج بلورة ثنائي الخلية.
كان أحد الاعتبارات الرئيسية في ابتكار هذا البروتوكول هو ضرورة إنتاج بروتين كبير في المراحل الأولية لتنقية البروتين ، مما يسمح بدرجة معينة من فقدان البروتين أثناء المعالجة السابقة للتبلور (الشكل 3). تتضمن الاستراتيجيات الشائعة لمواجهة هذا التحدي هندسة البروتين واسعة النطاق ، واستخدام مضيفات تعبير متنوعة ، واستكشاف تقويم العظام أو المتجانسات ، من بين مناهج أخرى. ومع ذلك ، مع هذا الإجراء الذي يبدو معقدا ، تم تحديد عدد من الخطوات المحورية التي تدعم نجاح البروتوكول وتوفر أيضا نظرة ثاقبة للقيود المحتملة التي قد تنشأ عند دراسة ناقلات ABC الأخرى أو البروتينات الغشائية بشكل عام.
أولا ، يستخدم هذا البروتوكول الطرد المركزي الشامل في كل خطوة لتقليل تراكم البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المراقبة المستمرة للثبات الحراري للبروتينات المنقاة أمر بالغ الأهمية. يستخدم المجهر الإلكتروني للتحقق من التشتت الأحادي للبروتين ، بينما يتتبع ترشيح الهلام التحليلي استقرار البروتين بمرور الوقت (الشكل 2). يمكن أيضا دمج تقنيات بديلة مثل ثنائية اللون الدائرية (CD) أو كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (DSC). علاوة على ذلك ، فإن دمج الدهون في مراحل محددة أمر ضروري لتحقيق أقصى قدر من النشاط والتبلور في ABCG5 / G8 المنقى. على سبيل المثال ، الكولات و CHS ضروريان لإظهار التحلل المائي ATP القابل للقياس. لا غنى عن الدهون الفوسفاتية للحفاظ على استقرار البروتينات الميثيلية ؛ والكوليسترول هو عنصر ضروري في محلول bicelle ، مما يعزز نمو البلورات المناسبة لحيود الأشعة السينية عالي الدقة (الشكل 4).
في جوهرها ، يمكن إنجاز الإجراء بأكمله في غضون أسبوع من الجهد. على عكس LCP ، فإن استرجاع البلورات من صواني التبلور المعلقة أمر مباشر. بالنظر إلى المستقبل ، مع إنتاجية كبيرة من البروتين (حوالي 10 ملغ) ، فإن هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة لتطوير التحقيقات البلورية التي تنطوي على طفرات ABCG5 / G8 أو بروتينات النقل الأخرى. هذا مهم بشكل خاص للحالات التي تتهرب حاليا من التصور من خلال المجهر الإلكتروني.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من خلال منحة اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة (RGPIN 2018-04070) ومنحة مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-180640) إلى JYL. يعتمد هذا البروتوكول على التقارير الأصلية في الهياكل البلورية ABCG5 / G8 التي أبلغ عنها سابقا فرحات وآخرون 22 ولي وآخرون 23.
Materials
| (NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
| ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
| ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
| ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
| CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
| CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
| Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
| CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
| Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
| CHS | Steraloids | C6823-000 | |
| DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
| DMNG | Anatrace | NG322 | |
| DMPC | Anatrace | D514 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPC | Anatrace | D518 | |
| DOPE | Avanti | 850725 | |
| DTT | Fisher | BP172 | |
| Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
| EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
| EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
| Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
| Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
| Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
| Glycerol | BioShop | GLY004 | |
| HEPES | BioShop | HEP001 | |
| HRV-3C protease | Homemade | ||
| Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
| Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
| Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
| MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
| Methanol | Fisher | A412P | |
| MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
| microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
| NaCl | BioShop | SOD002 | |
| NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
| PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
| PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
| pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
| SDS | BioShop | SDS003 | |
| Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
| Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
| Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
| Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
| TCEP | |||
| TEM | FEI, Technai | ||
| Tris Base | Fisher | BP152 | |
| β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
| β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
| ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |
References
- Hamada, H., Tsuruo, T. Purification of the 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance. 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase. Journal of Biological Chemistry. 263 (3), 1454-1458 (1988).
- Higgins, F., Hiles, D., Whalley, K., Jamieson, J. Nucleotide binding by membrane components of bacterial periplasmic binding protein-dependent transport systems. The EMBO Journal. 4 (4), 1033-1039 (1985).
- Higgins, F., et al. A family of related ATP-binding subunits coupled to many distinct biological processes in bacteria. Nature. 323 (6087), 448-450 (1986).
- Horio, M., Gottesman, M., Pastan, I. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles from human multidrug-resistant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (10), 3580-3584 (1988).
- Mimmack, L., et al. Energy coupling to periplasmic binding protein-dependent transport systems: stoichiometry of ATP hydrolysis during transport in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (21), 8257-8261 (1989).
- Grundy, M. Absorption and Metabolism of Dietary Cholesterol. Annual Review of Nutrition. 3 (1), 71-96 (1983).
- Berge, E., et al. Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science. 290 (5497), 1771-1775 (2000).
- Repa, J., et al. Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the Liver X receptors α and β. Journal of Biological Chemistry. 277 (21), 18793-18800 (2002).
- Yu, L., et al. Stimulation of cholesterol excretion by the Liver X receptor agonist requires ATP-binding cassette transporters G5 and G8. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15565-15570 (2003).
- Yu, L., et al. Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol secretion. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 8742-8747 (2005).
- Lütjohann, D., Björkhem, I., Beil, F., von Bergmann, K. Sterol absorption and sterol balance in phytosterolemia evaluated by deuterium-labeled sterols: effect of sitostanol treatment. Journal of Lipid Research. 36 (8), 1763-1773 (1995).
- Miettinen, A. Phytosterolaemia, xanthomatosis and premature atherosclerotic arterial disease: a case with high plant sterol absorption, impaired sterol elimination and low cholesterol synthesis. European Journal of Clinical Investigation. 10 (1), 27-35 (1980).
- Salen, G., et al. Sitosterolemia. Journal of Lipid Research. 33 (7), 945-955 (1992).
- Caffrey, M. Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 108-132 (2003).
- Michel, H. Crystallization of membrane proteins. Trends in Biochemical Sciences. 8 (2), 56-59 (1983).
- Dürr, N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelleslights up membrane protein structure. Chemical Reviews. 112 (11), 6054 (2012).
- Dürr, N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: Birth and coming of age of lipid bicelles. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 69 (1), 1-22 (2013).
- Dufourc, J. Bicelles and nanodiscs for biophysical chemistry. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1863 (1), 183478 (2021).
- Beaugrand, M., et al. Lipid concentration and molar ratio boundaries for the use of isotropic bicelles. Langmuir. 30 (21), 6162-6170 (2014).
- Sanders, R., Schwonek, P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
- Seddon, M., Curnow, P., Booth, J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Farhat, D., et al. Structural analysis of cholesterol binding and sterol selectivity by ABCG5/G8. Journal of Molecular Biology. 434 (20), 167795 (2022).
- Lee, J. Y., et al. Crystal structure of the human sterol transporter ABCG5/ABCG8. Nature. 533 (7604), 561-564 (2016).
- Ujwal, R., Bowie, U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55 (4), 337-341 (2011).
- Johnson, H., Lee, J. Y., Pickert, A., Urbatsch, L. Bile acids stimulate ATP hydrolysis in the purified cholesterol transporter ABCG5/G8. Biochemistry. 49 (16), 3403-3411 (2010).
- Wang, Z., et al. Purification and ATP hydrolysis of the putative cholesterol transporters ABCG5 and ABCG8. Biochemistry. 45 (32), 9929-9939 (2006).
- Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14 (3), 836-840 (2005).
