ABCG5/G8-Kristallisation in einer lipidischen Bizellenumgebung für die Röntgenkristallographie

1. Klonierung und Proteinexpression Klonen Sie das humane ABCG5/G8-Gen in Pichia pastoris-Hefe gemäß den vorherigen Protokollen25,26. Kurz gesagt, leiten Sie pSGP18 und pLIC Expressionsvektoren aus pPICZB ab. Fügen Sie eine Markierung hinzu, die eine 3C-Proteasestelle des Rhinovirus kodiert, gefolgt von einem Calmodulin-bindenden Peptid (CBP) am C-Terminus der ABCG8-cDNA (pSGP18-G8-3C-CBP).Fügen Sie eine durch ein Glycin getrennte Sechs-Histidin-Markierung (His 6, GlyHis6) zum C-Terminus der ABCG5-cDNA (pLIC-G5-H12) hinzu. Co-Transformation der Plasmide in Pichia-Stamm KM71H mittels Elektroporation.HINWEIS: Bitte beachten Sie die Materialtabelle für die Details der verwendeten Plasmide, Medien und Puffer. Transformierte Hefezellen werden auf MD-Agarplatten bei 28 °C gezüchtet. Wählen Sie nach 1-2 Tagen 10-12 Kolonien aus und inokulieren Sie sie mit 50-ml-Zentrifugenröhrchen für die Kultur in kleinem Maßstab in 10 ml MGY-Medien (Minimal Glycerin-Hefe-Stickstoffbasis).Drei kleine Löcher in den Deckel des Zentrifugenröhrchens bohren, um eine bessere Belüftung zu gewährleisten. Lassen Sie die Zellen bei 28 °C unter ständigem Schütteln bei 250 U/min wachsen, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD600) 10 erreicht, was normalerweise 1-2 Nächte dauert.HINWEIS: Das Zellwachstum dauert in der Regel zwischen 12 und 24 Stunden. Nehmen Sie am nächsten Tag 1 l steriles MGY-Medium und impfen Sie es mit der Primärkultur in einem 2,4-l-Kolben. Der Kolben wird bei 28 °C in einem Schüttel-Inkubator bei 250 U/min für 24 h inkubiert.Um den pH-Wert zwischen 5-6 zu halten, fügen Sie 10% Ammoniumhydroxid (NH4OH) hinzu, bis sich der pH-Wert stabilisiert hat. Passen Sie den pH-Wert an und induzieren Sie die Proteinexpression, indem Sie 1 ml reines Methanol pro 1-Liter-Kultur (0,1 % (v/v) Methanol) hinzufügen).HINWEIS: Die Zellen werden anschließend alle 12 h für eine Gesamtdauer von 36-48 h mit 5 ml reinem Methanol pro Literkultur (0,5 % (v/v) Methanol) gefüttert. Erntezellen durch Zentrifugieren bei 15.000 x g für 30 min bei 4 °C. Die Zellpellets werden gesammelt und in einem Lysepuffer (0,33 M Saccharose, 0,3 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M Aminohexansäure, 1 mM EDTA und 1 mM EGTA) auf eine Konzentration von 0,5 g/ml resuspendiert. Lagern Sie die Suspension bei -80 °C. Typischerweise kann man 30 ± 5 g Zellmasse aus 1 l kultivierten Zellen gewinnen.HINWEIS: Lagern Sie Zellpellets direkt im Gefrierschrank oder führen Sie eine sofortige Resuspension in Lysepuffer für Membranpräparationen durch. 2. Vorbereitung der mikrosomalen Membran Tauen Sie die Zellen auf und fügen Sie Proteasehemmer hinzu (2 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Pepstatin A, 2 mM PMSF, siehe Materialtabelle).Um die Zellen weiter zu lysieren, verwenden Sie einen eisgekühlten Emulgator oder Mikrofluidisierer (siehe Materialtabelle) bei 25.000-30.000 psi. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-4 Mal. Zentrifuge zur Entfernung von Zelltrümmern: Schleudern bei 3.500-4.000 x g für 15 min, gefolgt von einem zweiten Schleudern bei 15.000 x g für 30 min. Beide Schleudergänge bei 4 °C halten. Um mikrosomale Membranvesikel zu isolieren, wird der Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen überführt und 1,5 h lang bei 4 °C bei 2,00.000 x g ultrazentrifugiert.Resuspendieren Sie das Membranpellet in 50 ml Puffer A (50 mM Tris-Cl pH 8,0, 100 mM NaCl und 10 % Glycerin) mit einem Unzenhomogenisator. Lagern Sie die Suspension bei -80 °C. 3. Proteinherstellung – Reinigung von Heterodimeren Tauen Sie die gefrorenen mikrosomalen Membranen auf und stellen Sie die Konzentration mit Hilfe eines Solubilisierungspuffers auf 4-6 mg/ml ein. Der Puffer sollte 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 % Glycerin, 1 % (w/v) β-Dodecylmaltosid (β-DDM), 0,5 % (w/v) Cholat, 0,1 % (w/v) Cholesterylhemisuccinat (CHS), 5 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol (β-ME), 2 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Pepstatin A und 2 mM PMSF enthalten (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Man kann gleiche Volumina des Membranpräparats und des Solubilisierungspuffers mischen oder 2x Solubilisierungspuffer ohne Proteaseinhibitoren und Reduktionsmittel verwenden. Das kurze Sieden des Puffers trägt dazu bei, CHS effizient aufzulösen. Verwenden Sie zur Reinigung nur den 4 °C gekühlten Puffer.Die Mischung bei mittlerer Geschwindigkeit 1 h bei 4 °C rühren. Anschließend mit zusätzlichem Rühren bei Raumtemperatur (RT) für 20-30 min umrühren. Die Mischung wird bei 1,00,000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert, um unlösliche Membranen zu entfernen. Sammeln Sie den gelösten Überstand und fügen Sie 20 mM Imidazol und 0,1 mM TCEP hinzu. Affinitätssäulenchromatographie26 durchführen: Binden Sie den solubilisierten Überstand über Nacht an voräquilibrierte Ni-NTA-Kügelchen (10-15 ml) (siehe Materialtabelle) in Puffer A (Schritt 2.2.1).HINWEIS: Vermeiden Sie ab diesem Zeitpunkt die Verwendung von Glycerin in laufenden Puffern.Die Säule wird zweimal mit 10 Säulenvolumina Puffer B (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % (w/v) β-DDM, 0,05 % (w/v) Cholat, 0,01 % (w/v) CHS, 0,1 mM TCEP) mit 25 mM Imidazol gewaschen. Waschen Sie die Säule mit 10 Säulenvolumina Puffer B mit 50 mM Imidazol. Das Protein wird mit Buffer C (Buffer B mit 200 mM Imidazol) eluiert. Zu den eluierten Proteinen werden 1 mM TCEP (siehe Materialtabelle) und 10 mM MgCl2gegeben. Validieren Sie die eluierten Fraktionen auf einem SDS-PAGE-Gel, um die korrekte Proteingröße26 zu bestätigen.HINWEIS: Typische Proteinausbeute (1. Ni-NTA): 10-20 mg Protein pro 6-Liter-Kultur. Verwenden Sie DDM mit dem 10- oder 5-fachen der kritischen Mizellenkonzentration (CMC), etwa 0,01 %. Dieses Protokoll verwendet 0,1 % DDM. Verdünnen Sie die Spitzenfraktionen aus der Ni-NTA-Elution mit einem gleichen Volumen Puffer D1 (Puffer B mit 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2), mischen Sie und laden Sie die Proteinfraktionen auf eine CBP-Säule (3-5 ml) (siehe Materialtabelle), die mit CBP-Waschpuffer D1 voräquilibriert wurde. Führen Sie sequentielle Waschvorgänge an der CBP-Säule durch, um Reinigungsmittel mit Puffer D1 und D2 auszutauschen (Puffer B mit 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 0,1 % (w/v) Decylmaltose-Neopentylglykol (DMNG), ohne β-DDM): Zuerst mit 3 Säulenvolumina D1 waschen; zweitens mit 3 Säulenvolumina D1:D2 (3:1, v/v) waschen; drittens mit 3 Säulenvolumina D1:D2 (1:1, v/v) waschen; Im vierten Schritt wird mit 3 Säulenvolumina D1:D2 (1:3, v/v) gewaschen, gefolgt von 6-10 Säulenvolumina D2. Das Protein wird mit CBP-Waschpuffer D2 mit 300 mM NaCl in 1-ml-Fraktionen aus der CBP-Säule (insgesamt 10 ml) eluiert. Konzentrieren Sie die eluierten Fraktionen auf 1-2 ml.HINWEIS: Die typische Proteinausbeute (1. CBP) beträgt 5-15 mg Protein pro 6-Liter-Kultur. Maltose-Neopentyl-Glykol (MNG)-Detergenzien verbessern die gereinigte Proteinspeicherung bei 4 °C. Es wurden sowohl DMNG als auch Lauryl MNG (LMNG) verwendet, wobei DMNG bessere Röntgenbeugungskristalle lieferte. Verwenden Sie DMNG bei 10-20x seiner kritischen Mizellenkonzentration (CMC), ca. 0,003%. Dieses Protokoll verwendete 0,1 % DMNG. Ein Teil des CBP-Eluats kann durch Gelfiltrationschromatographie (Schritt 4.4.) weiter gereinigt werden, um die ATPase-Aktivität von Proteinen zu analysieren oder die Monodispersität durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zu beurteilen. 4. Proteinvorbereitungs-Vorkristallisationsbehandlung Spalten Sie die N-verknüpften Glykane und CBP-Tags mit Endoglycosidase H (Endo H, ~0,2 mg pro 10-15 mg gereinigtem Protein) bzw. HRV-3C-Protease (~2 mg pro 10-15 mg gereinigtes Protein) (siehe Materialtabelle). Über Nacht bei 4 °C inkubieren. Während der Endo-H- und 3C-Protease-Inkubation wird eine reduktive Alkylierung an den gepoolten Proteinen durchgeführt. Beginnen Sie mit der Inkubation mit 20 mM Jodacetamid (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 °C. Es folgt eine 1-stündige Inkubation mit zusätzlich 2 mM Jodacetamid auf Eis.HINWEIS: Dieser Schritt stabilisiert die Proteinspeicherung für bis zu einem Monat bei 4 °C. Verwenden Sie eine zweite CBP-Säule (1-2 ml), um das gespaltene CBP-Tag zu trennen. Verwenden Sie für diesen Vorgang Puffer D2.HINWEIS: Die typische Proteinausbeute (2. CBP) beträgt 5-10 mg Protein pro 6-Liter-Kultur. Reinigen Sie das CBP-Tag-freie Protein mit Hilfe der Gelfiltrationschromatographie. Der Puffer sollte 10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % (w/v) DMNG, 0,05 % (w/v) Cholat und 0,01 % (w/v) CHS enthalten.HINWEIS: Die typische Proteinausbeute (Gelfiltration) beträgt 2-8 mg Protein pro 6-Liter-Kultur. Während dieses Schrittes deutet das Fehlen eines DDM-Peaks (~65 kD) während der Gelfiltration auf einen erfolgreichen Detergenzienaustausch zu DMNG hin. Modifizieren Sie die gepoolten Proteinfraktionen durch reduktive Methylierung: Geben Sie 20 mM Dimethylaminboran (DMAB, siehe Materialtabelle) und 40 mM Formaldehyd zum Protein. 2 h bei 4 °C auf einem oszillierenden Schüttler inkubieren. Fügen Sie 10 mM DMAB hinzu.Wiederholen Sie Schritt 4.5, einschließlich der Zugabe von 10 mM DMAB, und inkubieren Sie über Nacht (12-18 h) bei 4 °C. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 mM Tris-Cl, pH 7,5. Laden Sie das methylierte Protein auf eine 2-ml-Ni-NTA-Säule, die mit 100 mM Tris-Cl, pH 8,0 und 100 mM NaCl voräquilibriert ist.Waschen Sie die Säule mit 10 Säulenvolumina Waschpuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, mit 0,5 mg/ml DOPC: Dope (3:1, w/w), 0,1 % (w/v) DMNG, 0,05 % (w/v) Cholat, 0,01 % (w/v) CHS). Das relipidierte Protein wird mit Hilfe von Elutionspuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 200 mM Imidazol, 0,5 mg/ml DOPC: Dope (1:1, w/w), 0,1 % (w/v) DMNG, 0,05 % (w/v) Cholat, 0,01 % (w/v) CHS) eluiert.HINWEIS: Die typische Proteinausbeute (2. Ni-NTA) beträgt 1-5 mg Protein pro 6-Liter-Kultur. Die Proteineluate werden durch eine PD-10-Entsalzungssäule geleitet, die mit dem in Schritt 4.4 verwendeten Puffer voräquilibriert ist. Das entsalzte und relipidierte Protein wird über Nacht mit Cholesterin (hergestellt in Isopropanol oder Ethanol) auf eine Endkonzentration von ~20 μM inkubiert.Am nächsten Morgen wird das Fällmittel durch Ultrazentrifugation bei 1,50.000 x g für 10 min bei 4 °C entfernt. Sammle den Überstand ein. Konzentrieren Sie das Protein auf eine Endkonzentration von 30-50 mg/ml unter Verwendung eines 100-kDa-Cutoff-Zentrifugalkonzentrators. Entnehmen Sie das Fällmittel mit einer gekühlten Tischzentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 30 Minuten bei 4 °C. Halten Sie den Überstand auf Eis bei 4 °C und stellen Sie Kristallisationsbedingungen in den Bizellen her.HINWEIS: Die konzentrierten Proteine sollten innerhalb einer Woche für die Kristallzüchtung verwendet werden. Frieren Sie die Proteine nicht ein. 5. Proteinkristallisation in Bizellen Bereiten Sie eine 10%ige Bizellen-Stammlösung mit DMPC-Lipiden und CHAPSO-Reinigungsmittel in einem Verhältnis von 3:1 (w/w) vor (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Verwenden Sie CHAPSO bei 5x seiner kritischen Mizellenkonzentration (CMC), ca. 0,5%. Dadurch wird die Detergenzienkonzentration um den CMC im Protein-Bizellen-Gemisch aufrechterhalten (Schritt 5.2).DeionisiertesH2O-gelöstesReinigungsmittel (CHAPSO) zu vorgetrockneten Lipiden (Mischung aus 5 mol% Cholesterin und 95 mol% DMPC) geben.HINWEIS: Bereiten Sie verschiedene Lipidzusammensetzungen in Chloroform vor und trocknen Sie sie in einem Glasreagenzglas mit einem Stickstoffgasstrom bei RT. Entfernen Sie Lösungsmittelreste, indem Sie sie über Nacht in eine Vakuumkammer geben, wodurch eine dünne Lipidschicht entsteht. Resuspendieren Sie Lipide und Reinigungsmittel mit einem Wasserbad-Ultraschallgerät. Beschallen Sie die Bizellenmischung in eisgekühltem Wasser mit kontinuierlicher Kraft, bis die Lösung durchsichtig wird.HINWEIS: Verwenden Sie einen Gehörschutz und sorgen Sie für eine ausreichende Eisversorgung, um das Gemisch in einer flüssigen Phase zu halten. Ungelöste Bestandteile mit einem 0,2 μm Zentrifugalfilter entfernen (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Lagern Sie die aliquotierte Bizellenlösung bei -80 °C. Erzeugen Sie eine Protein-Bizelle-Mischung auf Eis, indem Sie vorsichtig 10 % Bizellen (Schritt 5.1.4) und Proteine (Schritt 4.7.4) in einem Verhältnis von 1:4 (v/v) kombinieren, um eine endgültige Proteinkonzentration zwischen 5 und 10 mg/ml zu erreichen. Die Mischung aus Protein und Bizelle 30 Minuten auf Eis inkubieren. Richten Sie Kristallisationsbedingungen in einem hängenden Tropfendampfdiffusionsformat mit 48-Well-Platten ein.Mischen Sie gleiche Volumina (0,5 oder 1 μl) der Protein/Bizell-Mischung und der Kristallisationsreservoirlösung, die 1,6 M-2,0 M Ammoniumsulfat, 100 mM MES (pH 6,5), 0%-4% PEG 400 und 1 mM TCEP enthält (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Erstellen Sie vor jedem Experiment eine Matrix der Lagerstättenlösung und passen Sie Ammoniumsulfat (1,6-2,0 M) und PEG 400 (0%-4%) an. Zur Kristallisation bei 20 °C inkubieren. Überprüfen Sie die Kristallisationsschalen am nächsten Tag, um eine ordnungsgemäße Versiegelung des Deckglases sicherzustellen. Überwachen Sie das Kristallwachstum mindestens einmal täglich. Hochwertige Kristalle erscheinen in der Regel innerhalb von 1-2 Wochen mit den Maßen 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm.HINWEIS: Bei niedrigeren Proteinkonzentrationen kann es länger dauern, bis sich Kristalle bilden. Reife Kristalle sollten innerhalb eines Monats geerntet werden. Proteinkristalle werden in 0,2 M Natriummalonat eingeweicht und mit 50 oder 100 μm Kryoschleifen in flüssigem Stickstoff schockgefroren.HINWEIS: Wenn ein Röntgendiffraktometer verfügbar ist, testen Sie einige Kristalle mit einem 15-30-minütigen Röntgenstrahl, um eine Beugung von bis zu 5 Å zu zeigen. Für die höher aufgelöste Beugung ist eine Synchrotronlichtquelle erforderlich. Mit 0,2 M Natriummalonat als Kryo-Schutzmittel kann ein Kristall mit den Maßen 100 μm x 50 μm x 2 μm etwa 90 Beugungsbilder mit Synchrotron-Röntgenstrahlung liefern.