Questo protocollo descrive una configurazione per la cristallizzazione del trasportatore di steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 viene ricostituito in bicelle per la cristallizzazione a goccia sospesa. Il protocollo non richiede materiali o substrati specializzati, il che lo rende accessibile e facile da adattare in qualsiasi laboratorio per determinare la struttura della proteina attraverso la cristallografia a raggi X.
I trasportatori a cassetta legante l’ATP (ABC) costituiscono proteine di membrana incorporate nei lipidi. L’estrazione di queste proteine di membrana dal doppio strato lipidico in un ambiente acquoso si ottiene in genere impiegando detergenti. Questi detergenti disintegrano il doppio strato lipidico e solubilizzano le proteine. L’habitat intrinseco delle proteine di membrana all’interno del doppio strato lipidico rappresenta una sfida nel mantenere la loro stabilità e uniformità in soluzione per la caratterizzazione strutturale. Le bicelle, che comprendono una miscela di fosfolipidi e detergenti a catena lunga e corta, replicano la struttura lipidica naturale. L’utilizzo di bicelle lipidiche e detergenti funge da sistema modello adatto per ottenere cristalli di diffrazione di alta qualità, in particolare per determinare la struttura ad alta risoluzione delle proteine di membrana. Attraverso questi microambienti sintetici, le proteine di membrana conservano la loro conformazione e funzionalità nativa, facilitando la formazione di cristalli tridimensionali. In questo approccio, l’eterodimerico solubilizzato ABCG5/G8 è stato reintegrato in bicelle DMPC/CHAPSO, integrate con colesterolo. Questa configurazione è stata impiegata nella procedura sperimentale di diffusione del vapore per la cristallizzazione delle proteine.
I trasportatori a cassetta legante l’ATP (ABC) costituiscono una superfamiglia di proteine di membrana responsabili di diversi processi di trasporto ATP-dipendenti attraverso le membrane biologiche 1,2,3,4,5. Queste proteine trasportatrici sono implicate nelle malattie cardiovascolari e svolgono un ruolo significativo nel facilitare l’efflusso di colesterolo nella bile per la successiva escrezione nel fegato. Di conseguenza, il metabolismo e l’equilibrio del colesterolo hanno suscitato un notevole interesse nel corso degli anni6. Un meccanismo specifico coinvolto nell’eliminazione del colesterolo e di altri steroli dall’organismo coinvolge i membri della sottofamiglia ABCG umana, in particolare l’eterodimerico ABCG5/G8 7,8,9,10. Le mutazioni in uno di questi geni interrompono l’eterodimero, portando alla perdita di funzione e causando sitosterolemia, una malattia che colpisce il traffico di steroli11,12,13. Data la rilevanza della malattia e il loro ruolo nel promuovere l’efflusso del colesterolo, i trasportatori di steroli hanno attirato un’attenzione significativa. Tuttavia, gli intricati dettagli del loro meccanismo molecolare e della selettività del substrato rimangono in gran parte non divulgati. Pertanto, la delucidazione della struttura cristallina di ABCG5/G8 è un passo cruciale verso la comprensione dei meccanismi e delle funzioni a valle nel trasporto del colesterolo.
Le proteine di membrana richiedono l’ancoraggio all’interno delle membrane per ripiegarsi e funzionare correttamente. Di conseguenza, l’estrazione delle proteine di membrana dal loro ambiente naturale spesso provoca instabilità proteica, misfolding e perdita di funzione14,15. Queste sfide sottolineano i principali ostacoli affrontati nella cristallizzazione delle proteine di membrana. Tuttavia, la ricostituzione delle proteine in doppi strati detergenti sintetici, come le bicelle, è emersa come una soluzione a questa situazione, consentendo il mantenimento delle proteine di membrana all’interno di un ambiente a doppio strato simile a quello nativo16. Le bicelle sono assemblaggi di fosfolipidi e detergenti sintetici sospesi e solubilizzati in acqua. In particolare, adottano una struttura a doppio strato che imita le membrane biologiche16,17,18. Le bicelle possono passare dalla fase liquida a quella gel in base alla temperatura e alla viscosità. La cristallizzazione bicellare sfrutta i piccoli dischi a doppio strato e la bassa viscosità a temperature ridotte, facilitando la miscelazione accurata di proteine e soluzioni bicellari. La dimensione delle bicelle dipende dal rapporto detergente/lipidi durante la preparazione19,20. I detergenti prevalenti per la formazione di bicelle includono il 3-[(3-colamidopropil)dimetilammonio]-2-idrossi-1-propansolfonato (CHAPSO), insieme al 3-[(3-colamidopropil)dimetilammonio]-1-propansolfonato (CHAPS) e all’1,2-ditridecanoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina (DHPC)21. Questi detergenti sono utilizzati in combinazione con lipidi come la di-miristoil-fosfatidilcolina (DMPC) e la 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC). Inoltre, recenti studi hanno dimostrato la piena funzionalità delle proteine di membrana all’interno delle bicelle in condizioni fisiologiche. Ad esempio, Lee e colleghi hanno cristallizzato e riportato con successo la struttura cristallina di ABCG5/ABCG8 sulla base di un doppio strato lipidico22,23. Nel processo di cristallizzazione, le miscele proteina-bicelle possono essere adattate utilizzando attrezzature standard, compresi i robot di cristallizzazione ad alto rendimento24. La fattibilità dell’utilizzo delle bicelle, tuttavia, dipende dalla termostabilità delle proteine dovuta alle condizioni di cristallizzazione a temperature più elevate. Tuttavia, rispetto ad altre tecniche, le condizioni di cristallizzazione richieste per le proteine di membrana rimangono generalmente miti, coinvolgendo basse concentrazioni di precipitante, sale e tampone. Ciò rende sia le miscele proteina-bicelle che la diffusione del vapore strumenti efficaci e facilmente implementabili per gli studi strutturali delle proteine di membrana.
Questo protocollo delinea le fasi essenziali nella preparazione delle proteine e nella cristallizzazione bicellulare per determinare la struttura cristallina a raggi X di ABCG5/G8 ad alta risoluzione (Figura 1).
Le sfide associate alla cristallizzazione delle proteine di membrana hanno spinto lo sviluppo di metodi di cristallizzazione guidati da doppio strato lipidico, come gli approcci bicellari27 o in fase cubica lipidica (LCP)14 . Tuttavia, il raggiungimento di una cristallizzazione di successo delle proteine di membrana dipende ancora dalla fase critica e talvolta strozzante della preparazione delle proteine. In particolare, i trasportatori ABC rappresentano un formidabile ostacolo nella crescita di cristalli adatti alla cristallografia a raggi X. Questo protocollo fornisce una guida pratica completa per semplificare la preparazione del trasportatore di steroli umano ABCG5/G8 e promuovere la crescita dei cristalli attraverso l’approccio di cristallizzazione bicellulare.
Una considerazione chiave nell’ideazione di questo protocollo è stata l’imperativo di una sostanziale resa proteica nelle fasi iniziali della purificazione proteica, consentendo un certo grado di perdita proteica durante il trattamento di pre-cristallizzazione (Figura 3). Le strategie comuni per affrontare questa sfida coinvolgono un’ampia ingegneria proteica, l’utilizzo di diversi ospiti di espressione e l’esplorazione di ortologhi o omologhi, tra gli altri approcci. Tuttavia, con questa procedura apparentemente intricata, sono stati identificati una serie di passaggi fondamentali che sono alla base del successo del protocollo e forniscono anche informazioni sui potenziali limiti che possono sorgere quando si studiano altri trasportatori ABC o proteine di membrana in generale.
In primo luogo, questo protocollo impiega un’accurata centrifugazione in ogni fase per ridurre al minimo l’aggregazione proteica. Inoltre, il monitoraggio continuo della termostabilità delle proteine purificate è fondamentale. La microscopia elettronica viene utilizzata per verificare la monodispersità delle proteine, mentre la filtrazione analitica su gel tiene traccia della stabilità delle proteine nel tempo (Figura 2). Potrebbero essere incorporate anche tecniche alternative come il dicroismo circolare (CD) o la calorimetria differenziale a scansione (DSC). Inoltre, l’incorporazione di lipidi in stadi specifici è essenziale per massimizzare sia l’attività che la cristallogenesi dell’ABCG5/G8 purificato. Ad esempio, il colato e la CHS sono necessari per esibire un’idrolisi misurabile dell’ATP; i fosfolipidi sono indispensabili per mantenere la stabilità delle proteine metilate; e il colesterolo è un componente necessario della soluzione bicellare, favorendo la crescita di cristalli adatti alla diffrazione di raggi X ad alta risoluzione (Figura 4).
In sostanza, l’intera procedura può essere eseguita in una settimana di sforzo. A differenza dell’LCP, il recupero dei cristalli dai vassoi di cristallizzazione a goccia sospesa è semplice. Guardando al futuro, con una notevole resa proteica (circa 10 mg), questo protocollo è facilmente adattabile per lo sviluppo di indagini cristallografiche che coinvolgono mutanti ABCG5/G8 o altre proteine trasportatrici. Ciò è particolarmente pertinente per i casi che attualmente sfuggono alla visualizzazione attraverso la microscopia elettronica.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato da una sovvenzione per la scoperta del Natural Sciences and Engineering Research Council (RGPIN 2018-04070) e da una sovvenzione per il progetto di ricerca del Canadian Institutes of Health (PJT-180640) a JYL. Questo protocollo si basa sui rapporti originali nelle strutture cristalline ABCG5/G8 riportati in precedenza da Farhat et al.22 e Lee et al.23.
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |