Ce protocole décrit une configuration pour la cristallisation du transporteur de stérols ABCG5/G8. ABCG5/G8 est reconstitué en bicelles pour la cristallisation en gouttes suspendues. Le protocole ne nécessite pas de matériaux ou de substrats spécialisés, ce qui le rend accessible et facile à adapter dans n’importe quel laboratoire pour déterminer la structure de la protéine par cristallographie aux rayons X.
Les transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) constituent des protéines membranaires enrobées de lipides. L’extraction de ces protéines membranaires de la bicouche lipidique vers un environnement aqueux est généralement réalisée à l’aide de détergents. Ces détergents désintègrent la bicouche lipidique et solubilisent les protéines. L’habitat intrinsèque des protéines membranaires au sein de la bicouche lipidique pose un défi dans le maintien de leur stabilité et de leur uniformité en solution pour la caractérisation structurale. Les bicelles, qui comprennent un mélange de phospholipides et de détergents à chaîne longue et courte, reproduisent la structure lipidique naturelle. L’utilisation de bicelles lipidiques et de détergents sert de système modèle approprié pour obtenir des cristaux de diffraction de haute qualité, en particulier pour déterminer la structure à haute résolution des protéines membranaires. Grâce à ces microenvironnements synthétiques, les protéines membranaires préservent leur conformation et leur fonctionnalité natives, facilitant la formation de cristaux tridimensionnels. Dans cette approche, l’hétérodimérique ABCG5/G8 solubilisé par le détergent a été réintégré dans les bicelles DMPC/CHAPSO, complété par du cholestérol. Cette configuration a été utilisée dans la procédure expérimentale de diffusion de vapeur pour la cristallisation des protéines.
Les transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) constituent une superfamille de protéines membranaires responsables de divers processus de transport dépendants de l’ATP à travers les membranes biologiques 1,2,3,4,5. Ces protéines transporteuses sont impliquées dans les maladies cardiovasculaires et jouent un rôle important dans la facilitation de l’efflux de cholestérol vers la bile pour une excrétion ultérieure dans le foie. Par conséquent, le métabolisme et l’équilibre du cholestérol ont suscité un intérêt considérable au fil des ans6. Un mécanisme spécifique impliqué dans l’élimination du cholestérol et d’autres stérols de l’organisme implique des membres de la sous-famille des ABCG humains, notamment l’ABCG5/G8 hétérodimérique 7,8,9,10. Des mutations dans l’un ou l’autre de ces gènes perturbent l’hétérodimère, entraînant une perte de fonction et provoquant une sitostérolémie, un trouble affectant le trafic des stérols11,12,13. Compte tenu de la pertinence de la maladie et de leur rôle dans la promotion de l’efflux de cholestérol, les transporteurs de stérols ont attiré une attention importante. Néanmoins, les détails complexes de leur mécanisme moléculaire et de leur sélectivité du substrat restent largement non divulgués. Ainsi, l’élucidation de la structure cristalline d’ABCG5/G8 est une étape cruciale vers la compréhension des mécanismes et des fonctions en aval du transport du cholestérol.
Les protéines membranaires ont besoin d’un ancrage à l’intérieur des membranes pour se replier et fonctionner correctement. Par conséquent, l’extraction des protéines membranaires de leur environnement naturel entraîne souvent une instabilité des protéines, un mauvais repliement et une perte de fonction14,15. Ces défis soulignent les principaux obstacles rencontrés dans la cristallisation des protéines membranaires. Cependant, la reconstitution des protéines en bicouches de détergents synthétiques, comme les bicelles, est apparue comme une solution à cette situation difficile, permettant le maintien des protéines membranaires dans un milieu de bicouche de type natif16. Les bicelles sont des assemblages de phospholipides et de détergents synthétiques en suspension et solubilisés dans l’eau. Notamment, ils adoptent une structure bicouche qui imite les membranes biologiques16,17,18. Les bicelles peuvent passer de la phase liquide à la phase gel en fonction de la température et de la viscosité. La cristallisation bicellaire tire parti des petits disques bicouches et de la faible viscosité à des températures réduites, ce qui facilite le mélange complet des protéines et des solutions bicellaires. La taille des bicelles dépend du rapport détergent/lipide lors de la préparation19,20. Les détergents les plus répandus pour la formation de bicelles comprennent le 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO), ainsi que le 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) et le 1,2-ditridecanoyl-sn-glycérol-3-phosphocholine (DHPC)21. Ces détergents sont utilisés en conjonction avec des lipides tels que la di-myristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) et la 1-palmitoyl-2-oléoyl-phosphatidylcholine (POPC). De plus, des études récentes ont démontré la pleine fonctionnalité des protéines membranaires dans les bicelles dans des conditions physiologiques. Par exemple, Lee et ses collègues ont réussi à cristalliser et à rapporter la structure cristalline d’ABCG5/ABCG8 sur la base d’une bicouche lipidique22,23. Dans le processus de cristallisation, les mélanges protéine-bicelle peuvent être adaptés à l’aide d’équipements standard, y compris des robots de cristallisation à haut débit24. La faisabilité de l’utilisation des bicelles, cependant, dépend de la thermostabilité des protéines en raison des conditions de cristallisation à des températures plus élevées. Néanmoins, par rapport à d’autres techniques, les conditions de cristallisation requises pour les protéines membranaires restent généralement douces, impliquant de faibles concentrations de précipitant, de sel et de tampon. Cela rend à la fois les mélanges protéine-bicellaire et la diffusion de vapeur des outils efficaces et faciles à mettre en œuvre pour les études structurales des protéines membranaires.
Ce protocole décrit les étapes essentielles de la préparation des protéines et de la cristallisation bicellaire pour déterminer la structure cristalline en rayons X d’ABCG5/G8 à haute résolution (Figure 1).
Les défis associés à la cristallisation des protéines membranaires ont incité à la mise au point de méthodes de cristallisation basées sur les bicouches lipidiques, telles que les approches bicellaires27 ou en phase cubique lipidique (LCP)14 . Cependant, la réalisation d’une cristallisation réussie des protéines membranaires dépend toujours de l’étape critique et parfois goulot d’étranglement de la préparation des protéines. Notamment, les transporteurs ABC représentent un obstacle redoutable dans la croissance de cristaux adaptés à la cristallographie aux rayons X. Ce protocole fournit des conseils pratiques complets pour rationaliser la préparation du transporteur de stérols ABCG5/G8 humain et favoriser la croissance cristalline grâce à l’approche de cristallisation bicellaire.
L’un des principaux facteurs à prendre en compte lors de l’élaboration de ce protocole était l’impératif d’un rendement protéique substantiel dans les phases initiales de la purification des protéines, ce qui permet un certain degré de perte de protéines pendant le traitement de pré-cristallisation (Figure 3). Les stratégies courantes pour relever ce défi impliquent une ingénierie protéique approfondie, l’utilisation d’hôtes d’expression diversifiés et l’exploration d’orthologues ou d’homologues, entre autres approches. Néanmoins, avec cette procédure apparemment complexe, un certain nombre d’étapes cruciales ont été identifiées qui sous-tendent le succès du protocole et fournissent également des informations sur les limitations potentielles qui peuvent survenir lors de l’étude d’autres transporteurs ABC ou des protéines membranaires en général.
Tout d’abord, ce protocole utilise une centrifugation approfondie à chaque étape pour minimiser l’agrégation des protéines. De plus, une surveillance continue de la thermostabilité des protéines purifiées est cruciale. La microscopie électronique est utilisée pour vérifier la monodispersité des protéines, tandis que la filtration analytique sur gel permet de suivre la stabilité des protéines au fil du temps (Figure 2). Des techniques alternatives telles que le dichroïsme circulaire (CD) ou la calorimétrie différentielle à balayage (DSC) pourraient également être intégrées. De plus, l’incorporation de lipides à des stades spécifiques est essentielle pour maximiser à la fois l’activité et la cristallogenèse de l’ABCG5/G8 purifié. Par exemple, le cholate et le CHS sont nécessaires pour présenter une hydrolyse mesurable de l’ATP ; les phospholipides sont indispensables au maintien de la stabilité des protéines méthylées ; et le cholestérol est un composant nécessaire de la solution bicellaire, favorisant la croissance cristalline adaptée à la diffraction des rayons X à haute résolution (Figure 4).
Essentiellement, l’ensemble de la procédure peut être accompli en une semaine d’effort. Contrairement au LCP, la récupération des cristaux à partir de plateaux de cristallisation à gouttes suspendues est simple. À l’avenir, avec un rendement protéique substantiel (environ 10 mg), ce protocole est facilement adaptable pour le développement d’études cristallographiques impliquant des mutants ABCG5/G8 ou d’autres protéines de transport. Ceci est particulièrement pertinent pour les cas qui échappent actuellement à la visualisation par microscopie électronique.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux sont financés par une subvention à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN 2018-04070) et une subvention de projet des Instituts de recherche en santé du Canada (PJT-180640) à JYL. Ce protocole est basé sur les rapports originaux sur les structures cristallines ABCG5/G8 rapportés précédemment par Farhat et al.22 et Lee et al.23.
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |