Zebra Balığı Pul Rejenerasyonu Toto ve Ex Vivo Pul Kültürü

Üniversite Hayvan Bilimsel Birimi (ASU), zebra balığı yetiştiriciliği yönergelerinin rehberliğinde zebra balığı bakımından sorumludur. Ölçek toplama, canlı kemik boyama ve canlı görüntüleme dahil olmak üzere tüm prosedürler onaylandı ve Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı Proje Lisansı (PP4700996) kapsamında gerçekleştirildi. Bu el yazması için sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46] hattından genç ergin transgenik zebra balığıkullanılmıştır 17. Balıklar 4 aylık hem erkek hem de dişileri içeriyordu. 1. İn vivo ölçek rejenerasyonu Ölçek rejenerasyon deneyine başlamadan önce, zebra balıklarını ana tanklarından ayrı tanklara aktarın (Malzeme Tablosuna bakın) ve Şekil 2’de gösterildiği gibi deney boyunca görüntülemeyi takiben bu ayrı tanklara geri dönün. Bu, tüm yenilenen ölçeklerin deney için hasat edilenler olmasını sağlamak içindir; Grup barınağı, diğer balıkların neden olduğu yaralanmalar nedeniyle sporadik pul kaybına neden olabilir.NOT: Balıklar, balıklar arasında kavga ve ardından pul kaybını önlemek için ayrı ayrı yerleştirilir. Deney tasarımına göre her deney balığı için bilgileri (yani genotip, yaş ve cinsiyet) kaydedin. Balık boyutunu/uzunluğunu ve sağlık durumunu kaydetmek için bir cetvelin yanındaki her balığın görüntüsünü almak için bir kamera kullanın (akıllı telefon kameraları iyi çalışır). Deney gününde, zebra balığını %0,05 (h/h) trikain metan sülfonat (MS222, bkz . Malzeme Tablosu) kullanarak daldırarak uyuşturun, ardından görüntüleme veya hasat sırasında balığın hareket etmesini önlemek için nemli bir mendil ile bir Petri kabına yerleştirin. Balığı yan yatırın (burada kıvam için tipik olarak sol kanat kullanılır). Uygun büyütme oranına sahip bir stereomikroskop kullanarak yan görüntüleme gerçekleştirin (tipik olarak, ayrıntılı gözlem için hem genel yenilenme alanını hem de yakınlaştırılmış alanı yakalamak için bu çalışma için 2x, 4x ve/veya 6.3x ve 8x kullanılmıştır).NOT: Yan görüntüleme zaman noktaları, deneysel amaca ve transgenik raportörlerin seçimine bağlıdır. Örneğin, ölçek rejenerasyonu sırasında osteoblastları izlemek için önerilen zaman noktaları Gün 0 (ontogenetik), hasattan 2 gün sonra (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph’dir. Tekrarlanan anestezinin etkilerini azaltmak için, görüntüleme zaman noktalarını deney için gereken en az seviyede tutun. Stereomikroskop altında ince cımbız ve forseps kullanarak terazileri hasat edin. Hasat edilen pulları daha sonra kireç boyama için toplama tüplerine aktarın.NOT: Hasat edilebilecek maksimum ölçek sayısı, yürürlükte olan yerel etik onaylara bağlı olacaktır. Tipik olarak yaklaşık 20 ila 30 ölçek hasat ediyoruz ve bunları daha sonra ALP, von Kossa14 gibi ölçek boyama için ayrı toplama tüplerine topluyoruz. Ölçekleri 1.5 mL veya 2 mL’lik bir toplama tüpünde toplayın. Bu, kullanılan boyama tekniğine bağlıdır.Hem ALP hem de von Kossa boyaması için, ölçekleri deiyonize su içeren toplama tüplerine aktarırken, TRAP boyama veya immünohistokimya için ölçekleri %4 PFA (sabitleme solüsyonu) içeren toplama tüplerine aktarın. İsteğe bağlı: Terazileri tüplere aktarmadan önce, gerekirse tek tek hasat edilen kantarların görüntülerini yakalayın.NOT: Önerilen ölçek hasat zaman noktaları 0. gün (ontogenetik), 10. gün ve 21. gündür (yenilenen ölçekler). 2. Canlı kemik boyama NOT: Canlı iskelet boyama, deney balıkları floresan raportörler için transgenik olmadığında veya tek renkli transgenik raportörler taşırken gerçekleştirilebilir. Transgenikleri tamamlamak için canlı boyama kullanılabilir; örneğin, sp7 / osx gibi bir osteoblast raportörünü tek renkte (örneğin, GFP) kullanabilir, ardından kemiği Alizarin kırmızısı (AR) ile kırmızıya boyayabilir. AR ve kalsein yeşili aynı balıklar için birlikte kullanılabilir; Bu senaryoda AR, yaşlı kemiğin mineralize matrisine bağlanarak orijinal veya ontogenetik kemiği etiketlemek için kullanılır ve kalsein, yeni oluşan kemikte bol miktarda bulunan kalsiyum iyonlarına bağlanır. Örneğin, bir ontogenetik skala boyanırken, AR görselleştirilebilir, ancak ontogenetik pullar düşük seviyelerde yeni kemik oluşumuna sahip olduğundan kalsein yeşili olmayabilir veya minimal olabilir. Canlı Alizarin Kırmızısı (AR) boyama gerçekleştirin.% 0,5 (a/h) stok Alizarin çözeltisini (10 mL) 10 mL 1 M stok HEPES (son konsantrasyon, 10 mM) ile karıştırarak bir şişe 2x AR boyama çözeltisi hazırlayın (bkz. 1x Danieau solüsyonu ile 1 L’ye kadar doldurun ( Malzeme Tablosuna bakın). Çözelti karanlıkta tutulmalı veya folyo ile sarılmalıdır. Deney gününde, zebra balığı tesisine 500 mL 2x AR solüsyonu getirin ve 1x çalışan AR solüsyonu yapmak için 500 mL sistem suyu (akvaryumdan) ekleyin. Balıkları tanklarından 1x çalışan bir AR boyama solüsyonuna aktarın ve 15-20 dakika bekletin. Balıktaki fazla lekeyi sistem suyunda 15 dakika ‘yıkama’ ile yıkayın. Canlı Calcein Green boyama gerçekleştirin.900 mL 1x Danieau çözeltisine 45 mg Calcein tozu ekleyerek bir şişe 2x Calcein Green boyama solüsyonu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Tozun tamamen çözülmesini sağlamak için manyetik bir karıştırıcı kullanın. PH’ı 8’e ayarlayın. Bu, 2x stok Calcein Green çözümüdür. Çözelti karanlıkta saklanabilir/folyo ile sarılabilir 1 aya kadar. Deney gününde, zebra balığı tesisine 500 mL 2x Calcein Green solüsyonu getirin ve 1x çalışan Calcein Green solüsyonu yapmak için 500 mL sistem suyu ekleyin. Taze yapılmış Calcein boyama solüsyonu kullanılması tavsiye edilir. Balıkları tanklarından 1x çalışan Calcein Green boyama solüsyonuna aktarın ve 1-2 saat bekletin. Balığın büyüklüğüne bağlı olarak, daha uzun bir boyama süresi gerekebilir. Balıktaki fazla lekeyi sistem suyunda 15 dakika ‘yıkayarak’ yıkayın.NOT: Calcein Green lekeli balığı mümkün olan en kısa sürede hayal edin, çünkü bu leke birkaç saat içinde solacaktır. 3. Hasat sonrası pullarda alkalin fosfataz (ALP) boyaması 100 mM Tris’i (HCl ile pH 9.5) 100 mM NaCl ve 50 mM MgCl2 ile karıştırarak ALP boyama çözeltisini hazırlayın. Piyasada bulunan NBT/BCIP stok çözeltisini kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Terazileri deiyonize su içeren tüplere aktarın. Pulları ALP boyama solüsyonunda 5 dakika durulayın. Bu arada, 10 mL ALP boyama tamponuna 200 μL NBT/BCIP çözeltisi ekleyerek çalışan bir boyama çözeltisi hazırlayın. Bunun boyama sırasında taze olarak hazırlanması gerekir. Pulları 15 dakika boyunca çalışan ALP boyama solüsyonu ile boyayın. Teraziyi deiyonize suyla durulayarak reaksiyonu durdurun. 4. Hasat sonrası pullarda Von KOSSA boyama % 5 (a / h) gümüş nitrat çözeltisi hazırlayın. % 5 (a / h) sodyum tiyosülfat çözeltisi hazırlayın. Hasat edilen terazileri deiyonize su içeren tüplere aktarın. Pulları gümüş nitrat çözeltisinde güçlü ışık altında 40 dakika inkübe edin.NOT: Gümüş nitrat çıkarılması zor bir leke bıraktığı için KKD (kişisel koruyucu ekipman) kullanın. Terazileri iki kez 5 dakika boyunca deiyonize suyla yıkayın.NOT: Gümüş nitrat atıkları yerel yönergelere göre toplanmalı ve bertaraf edilmelidir. Ölçekleri sodyum tiyosülfatta 5 dakika inkübe edin. Terazileri iki kez 5 dakika boyunca deiyonize suyla yıkayın. 5. Kolorimetrik TUZAK boyama NOT: Ayrıntılı prosedür için lütfen daha önce yayınlanmış çalışmayabakın 18. Boyama solüsyonlarını hazırlayın.10 mg / mL Naphthol AS-MX fosfat çözeltisi hazırlayın.5 mg Naphthol AS-MX fosfat tartın (Malzeme Tablosuna bakınız). Çeker ocakta, 0,5 mL N, N’-dimetilformamid içeren bir tüp hazırlayın ve 10 mg/mL Naphthol AS-MX fosfat stok çözeltisi yapmak için 5 mg Naphthol AS-MX fosfatı 0,5 mL N, N’-dimetilformamid içinde çözün (hafifçe çalkalayın). 50 mM sodyum tartrat içinde 1,6 mM Fast Red Violet LB stok çözeltisi hazırlayın.pH 5’te 50 mL 0.1 M sodyum asetat hazırlayın (50 mL deiyonize suya 0.41015 g sodyum asetat ekleyin ve pH’ı 0 asetik asit ile 5’e ayarlayın). 0.575 g sodyum L-tartrat dibazik dihidratı (Malzeme Tablosuna bakınız) 50 mL 0.1 M sodyum asetat tamponunda (pH = 5) çözün. 30 mg hızlı kırmızı menekşe LB tuzu ekleyin. PBS-0.1Tx’i hazırlayın (500 μL Triton-X’i 500 mL PBS’de çözün).PBS-0.1Tw’yi hazırlayın (500 mL PBS’de 500 μL Tween-20’yi çözün). Çalışan bir TRAP çözümü hazırlayın.Her iki stok çözeltisini çeker ocakta karıştırın (50 mM sodyum tartrat içinde 0,5 mL 10 mg/mL Naftol AS-MX fosfat çözeltisi ve 50 mL 1,6 mM Fast Red Violet LB stok çözeltisi).NOT: Çalışma çözümü artık çeker ocak dışında kullanılabilir. Buzdolabında (folyoya sarılı) bir aya kadar saklanabilir. Antikorlardan veya fiksatiflere duyarlı diğer reaktiflerden ayrı kaplarda saklayın. Mümkün olduğunca ışıktan uzak tutun. İsteğe bağlı: PBS ve% 0.1 Tween-20 (PBS-0.1% Tw) içinde ağartma solüsyonu (TRAP boyanmış sonradan sabitlenmiş numunelerde) hazırlayın. %0,5 potasyum hidroksit (KOH) ( stok çözeltisinden (a/h)) ve %3 hidrojen peroksit (H2O2) ( stok çözeltisi, buzdolabında saklanan) içeren bir nihai konsantrasyon karışımı hazırlayın. Örnek fiksasyon gerçekleştirin.Terazileri oda sıcaklığında (RT) 4 dakika boyunca sallanan veya dönen 1x PBS’de PFA’da sabitleyin. %4 PFA’yı çıkarın ve PBS-0.1Tx ile her yıkamada 5 dakika boyunca en az 3 kez yıkayın. Doğrudan TRAP boyamaya geçin (en iyi yaklaşım) veya gece boyunca PBS-0.1 Tx’te saklayın. Ölçeklerin TRAP boyamasını gerçekleştirin.PBS-0.1 Tx çözeltisini çıkarın ve numuneleri tamamen kaplamak için kolorimetrik TRAP çalışma çözeltisini (adım 5.2.1) ekleyin (yani, 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL). RT’de 1-2 saat inkübe edin, karanlıkta sallayın. Leke solüsyonunu çıkarın ve her yıkamada 5 dakika boyunca PBS-0.1 Tw ile en az 3 kez yıkayın. Numuneleri RT’de 30 dakika boyunca karanlıkta hafifçe sallanarak %4 PFA’da sonradan sabitleyin. Her adımda 5 dakika boyunca PBS-0.1 Tw ile 3 kez yıkayarak PFA çözeltisini çıkarın.NOT: Numuneler (saklama solüsyonlarında/mikroskop lamlarına monte edilmiş) karanlıkta 4 °C’de süresiz olarak saklanabilir. 6. Lekeli pulların montajı 6 g gliserole 2,4 g Mowiol 4-88 kristali ekleyerek montaj ortamını hazırlayın (bkz. Tercih edilen herhangi bir montaj ortamı kullanılabilir. 6 mL deiyonize su ekleyin ve manyetik bir karıştırıcıda bir saat bekletin. 12 mL 0.2 M Tris (pH 8.5) ekleyin ve Mowiol kristalleri tamamen eriyene kadar yaklaşık 53 ° C’de inkübe edin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 2000 x g’da santrifüjleyerek çözeltiyi berraklaştırın. Çözeltiyi bir saklama kabına aktarın. Montaj ortamı dondurucuda yaklaşık 12 ay saklanabilir. Çözülmüş Mowiol solüsyonu 1 aya kadar stabildir. Ortamı monte ederken terazileri bir mikroskop lamına monte edin, üzerlerini bir lamel ile örtün ve mikroskop altında görüntüleyin. 7. Ex vivo ölçek kültürü NOT: Bu adım de Vrieze ve ark.12’den uyarlanmıştır. Pulları steril bir ortamda toplamadan önce, osteojenik ortamı ve kültür plakasını hazırlayın.Osteojenik Kültür Ortamı (OCM): Steril bir santrifüj tüpünde, %1 sığır buzağı serumu, %1 (%0.85 NaCl içinde 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid), %1 antibiyotik/antimikotik çözelti (100x) çözeltisi, 4 mM CaCl2, 10 mM β-Gliserofosfat, 1 nM sodyum piruvat ve %1 Amfoterisin B (isteğe bağlı) (bkz. OCM’yi steril bir reaktif haznesine dökün ve çok kanallı bir pipet kullanarak 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 μL ekleyin. 96 oyuklu plakayı kapatın ve plakayı saklayın. OCM buzdolabında kısa bir süre (gece boyunca 1 haftaya kadar) saklanabilir ve kullanımdan önce 28 °C’de saklanabilir. Kireç hasadı ve PBS yıkama gerçekleştirin.Terazileri steril cımbız/forseps kullanarak hasat edin ve steril bir PBS solüsyonu içeren bir Petri kabına koyun. Plaka kurulumunu gerçekleştirin.Steril forseps kullanarak her bir ölçeği Petri kabından 100 μL OCM (28 °C’ye ısıtılmış) ile 96 oyuklu plaka üzerindeki her bir oyuğa aktarın. Tüm ölçekler plakaya aktarıldıktan sonra, plakayı stereomikroskop altına getirin. Her bir teraziyi nazikçe kuyunun dibine taşımak için ince, steril bir pipet ucu kullanın ve görüntü alımı sırasında ışık yansımasını önlemek için kuyuların kenarından uzak tutun.NOT: Bu adım yalnızca canlı görüntüleme gerçekleştiriliyorsa gereklidir. Plakayı, pulların 7 güne kadar kültürlenebileceği inkübatöre veya Canlı Görüntüleme Sistemine (LIS, Malzeme Tablosuna bakın) (28 °C, %5 CO2’ye ayarlanmış) dikkatlice aktarın. OCM’yi yenileyin (isteğe bağlı).Buzdolabında saklanan OCM’yi 28 °C’ye ısıtın. 96 oyuklu plakayı dikkatlice steril bir ortama aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her oyuktan 50 μL aspire edin. Bunun için uçları duvarlara bastırın ve pulları aspire etmekten/hareket ettirmekten/çıkarmaktan kaçınmak için dibe kadar daldırmayın. Farklı koşullar için yeni ipuçları kullanın. OCM’yi steril bir reaktif haznesine dökün ve çok kanallı pipeti kullanarak her bir oyuğa 60 μL OCM ekleyin. Plakayı stereomikroskobun altına yerleştirin ve yanlış yerleştirilmiş ölçekler olup olmadığını kontrol edin (duvarlara çok yakın, yüzer veya ortam içinde dikey konumda). Gerekirse ince, steril bir pipet ucuyla yeniden konumlandırın. Plakayı inkübatöre/LIS’e geri yerleştirin.NOT: Deney sirkadiyen ritim (CR) içeriyorsa ortamı yenilemeyin, çünkü serum şoku biyolojik saati etkileyebilir. CR’yi okurken, ışık koşullarının da saati sıfırladığını not edin. Kültür sonrası ölçek boyama ve görüntüleme gerçekleştirin (isteğe bağlı).6 günlük kültürden sonra bunları sabitleyin ve yukarıda bahsedilen von Kossa ve ALP gibi uygun boyamalar için yönlendirin. Alternatif olarak, deney balığının floresan etiketi varsa, plakayı canlı bir görüntüleme sistemine koyun.NOT: Canlı görüntüleme sistemi kullanıyorsanız, deney için uygun bir sıcaklık veCO2 seviyesine ayarlandığından emin olun. Tipik olarak, bu çalışmada 28 °C ve% 5 CO2 kullanılmıştır. Tüm kuyucukların eşit şekilde görüntülenmesini sağlamak için uygun filtreleri ve görüntüleme zaman noktalarını (burada, osteoblast göçünü takip etmek için yeterli olan 2 veya 4 saatlik bir aralık kullanılmıştır) ve düşük büyütme hedeflerini (yani 4x) seçin. Bunun nedeni, terazilerin, özellikle ortam değişiklikleri sırasında kuyuların içinde hareket etme eğiliminde olmasıdır.