ゼブラフィッシュの鱗の再生 TOTO および Ex Vivo の鱗の培養

大学動物科学ユニット(ASU)は、ゼブラフィッシュの飼育ガイドラインの指導の下、ゼブラフィッシュのケアを担当しています。スケール採取、生きた骨染色、ライブイメージングを含むすべての手順は、英国内務省プロジェクトライセンス(PP4700996)の下で承認され、実施されました。この原稿では、sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46] 系統の若年成体のトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた17。魚には生後4ヶ月のオスとメスの両方が含まれていました。 1. in vivo スケール再生 鱗屑再生実験を開始する前に、図2に示すように、ゼブラフィッシュをメインの水槽から個々の水槽に移し(材料表を参照)、実験中のイメージング後にこれらの個々の水槽に戻します。これは、再生するすべての鱗が実験のために採取されたものであることを確認するためです。グループハウスでは、他の魚による怪我により、散発的に鱗がなくなる可能性があります。注:魚は、魚同士の争いやその後の鱗の減少を避けるために、個別に配置されています。 実験デザインに従って、各実験魚の情報(遺伝子型、年齢、性別)を記録します。カメラ(スマートフォンのカメラは正常に機能します)を使用して、定規の横で各魚の画像を撮影し、魚のサイズ/長さと健康状態を記録します。 実験当日は、0.05%(v/v)トリカインメタンスルホン酸塩(MS222、 材料表参照)を用いてゼブラフィッシュに浸漬麻酔し、イメージング中や収穫中にゼブラフィッシュが動かないように、湿らせた組織でペトリ皿に置きます。 魚を横向きに置きます(通常、ここでは一貫性のために左脇腹が使用されます)。実体顕微鏡を用いて適切な倍率で側面イメージングを行う(本研究では、通常、2倍、4倍、および/または6.3倍と8倍を使用して、再生領域全体とズームイン領域の両方をキャプチャして詳細に観察します)。注:フランクイメージングのタイムポイントは、実験目的とトランスジェニックレポーターの選択によって異なります。例えば、スケール再生中の骨芽細胞を追跡するために、推奨される時点は、0日目(個体発生)、収穫後2日(dph)、4 dph、7 dph、10 dph、14 dph、21 dphです。繰り返しの麻酔による影響を軽減するために、実験に必要なイメージングの時点を最小限に保ちます。 実体顕微鏡下で細いピンセットと鉗子を使用して鱗を採取します。収穫した鱗屑をコレクションチューブに移し、後で鱗屑を染色します。注:収穫できる鱗の最大数は、実施されている地域の倫理的承認によって異なります。通常、約20〜30個の鱗を収穫し、ALP、von Kossa14などのスケール染色のために個々の収集チューブに収集します。 スケールを1.5 mLまたは2 mLのコレクションチューブに集めます。これは、使用する染色技術によって異なります。ALP染色とvon Kossa染色では、脱イオン水を含むコレクションチューブにスケールを移しますが、TRAP染色または免疫組織化学では、スケールを4%PFA(固定液)を含むコレクションチューブに移します。 オプション:スケールをチューブに移す前に、必要に応じて、採取した個々のスケールの画像を撮影します。注:推奨されるスケールの収穫時点は、0日目(個体発生)、10日目、および21日目(再生スケール)です。 2.生きた骨染色 注:生きた骨格染色は、実験魚が蛍光レポーター用にトランスジェニックされていない場合、または単色のトランスジェニックレポーターを運搬している場合に実行できます。生染色は、トランスジェニックを補完するために使用できます。例えば、SP7/OSX などの骨芽細胞レポーターを1色(GFPなど)で使用し、骨をアリザリンレッド(AR)で赤色に染色します。ARとカルセイングリーンは、同じ魚に一緒に使用できます。このシナリオでは、ARを使用して、老化した骨の石灰化マトリックスに結合することにより、元の骨または個体発生的な骨を標識し、カルセインは新しく形成された骨に豊富に存在するカルシウムイオンに結合します。例えば、個体発生学的スケールを染色する場合、ARは可視化され得るが、個体発生学的スケールは新しい骨形成のレベルが低いため、カルセイングリーンが存在しないか、または最小限であり得る。 アリザリンレッド(AR)の生染色を行います。0.5%(w/v)ストックアリザリン溶液(10 mL)と10 mLの1 MストックHEPES(最終濃度、10 mM)を混合して、2x AR染色溶液のボトルを調製します( 材料表を参照)。 1x Danieau溶液で最大1 Lを補充します( 材料表を参照)。溶液は暗所に保管するか、ホイルで包む必要があります。 実験当日、ゼブラフィッシュの施設に2倍のAR溶液500mLを持参し、水槽の水500mLを加えて1倍のAR溶液を作ります。 魚を水槽から1倍のAR染色溶液に移し、15〜20分間放置します。システム水で15分間「洗浄」して、魚の余分な汚れを洗い流します。 カルセイングリーン染色をライブで行います。45 mgのカルセイン粉末を1x Danieau溶液900 mLに添加して、2x Calcein Green染色溶液のボトルを調製します( 材料表を参照)。マグネチックスターラーを使用して、粉末を完全に溶解させます。 pHを8に調整します。これは、カルセイングリーンの2倍のストックソリューションです。溶液は暗所で保存するか、ホイルで最大1か月間包むことができます。 実験当日、500 mLの2x Calcein Green溶液をゼブラフィッシュ施設に持参し、500 mLのシステム水を加えて1x Calcein Green溶液を作ります。作りたてのカルセイン染色液の使用をお勧めします。 水槽から1xのCalcein Green染色液に魚を移し、1〜2時間放置します。魚の大きさによっては、染色時間が長くなる場合があります。 システム水で15分間「洗浄」して、魚の余分な汚れを洗い流します。注:この染みは数時間で消えるので、カルセイングリーンで染色された魚をできるだけ早く画像化してください。 3. 収穫後の鱗屑のアルカリホスファターゼ(ALP)染色 100 mM Tris(pH 9.5 with HCl)を100 mM NaClおよび50 mM MgCl2と混合してALP染色溶液を調製します。 市販のNBT/BCIP原液をご使用ください( 材料表参照)。 スケールを脱イオン水の入ったチューブに移します。 鱗屑をALP染色液で5分間すすぎます。 その間、10 mLのALP染色バッファーに200 μLのNBT/BCIP溶液を添加して、作業染色溶液を調製します。これは、染色時に新たに調製する必要があります。 鱗屑をALP染色液で15分間染色します。 スケールを脱イオン水ですすいで反応を停止します。 4. 収穫後の鱗屑のフォン・コッサ染色 5%(w/v)の硝酸銀溶液を調製する。 5%(w / v)チオ硫酸ナトリウム溶液を調製します。 収穫したスケールを脱イオン水の入ったチューブに移します。 鱗屑を硝酸銀溶液中で強い光の下で40分間インキュベートします。注意: 硝酸銀は取り除くのが難しい汚れを残すため、PPE(個人用保護具)を着用してください。 はかりを脱イオン水で5分間2回洗浄します。注意: 硝酸銀廃棄物は、地域のガイドラインに従って収集および廃棄する必要があります。 鱗屑をチオ硫酸ナトリウム中で5分間インキュベートします。 はかりを脱イオン水で5分間2回洗浄します。 5. 比色TRAP染色 注:詳細な手順については、以前に公開された作品18を参照してください。 染色液を調製します。10 mg/mL Naphthol AS-MX リン酸溶液を調製します。5 mg のナフトール AS-MX リン酸を秤量します( 材料表を参照)。 ドラフト内で、0.5 mL の N,N’-ジメチルホルムアミドを含むチューブを調製し、5 mg の Naphthol AS-MX リン酸塩を 0.5 mL の N,N’-ジメチルホルムアミドに溶解して、10 mg/mL の Naphthol AS-MX リン酸塩のストック溶液を作ります (穏やかに振とう)。 50 mM 酒石酸ナトリウムに 1.6 mM の Fast Red Violet LB ストック溶液を調製します。pH 5 で 0.1 M 酢酸ナトリウム 50 mL を調製します (50 mL の脱イオン水に 0.41015 g の酢酸ナトリウムを加え、100% 酢酸で pH を 5 に調整します)。 0.575 g の酒石酸 L-酒石酸ナトリウム二水和物( 材料表を参照)を 50 mL の 0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH = 5)に溶解します。 30mgのファストレッドバイオレットLB塩を加えます。 PBS-0.1Txを調製する(Triton-X500 μLをPBS500 mLに溶解する)。PBS-0.1Twを調製する(500 μLのTween-20を500 mLのPBSに溶解する)。 実用的な TRAP ソリューションを準備します。両方のストック溶液をドラフト内で混合します(0.5 mL の 10 mg/mL ナフトール AS-MX リン酸溶液と 50 mM 酒石酸ナトリウム中の 1.6 mM Fast Red Violet LB ストック溶液 50 mL)。注意: 作業溶液は、ドラフトの外で使用できるようになりました。冷蔵庫(ホイルで包んだもの)で最長1ヶ月間保存できます。固定剤に敏感な抗体やその他の試薬とは別の容器に保管してください。できるだけ光を避けてください。 オプション:PBSおよび0.1% Tween-20(PBS-0.1%Tw)で漂白溶液(TRAP染色した固定後サンプル)を調製します。 0.5%水酸化カリウム(KOH)(10%原液(w / v)から)および3%過酸化水素(H2O2)(33%原液、冷蔵庫に保管)の最終濃度混合物を調製する。 試料固定を行います。4% PFAの4%スケールを室温(RT)で40分間揺動または回転させる1x PBSで固定します。 4%PFAを除去し、PBS-0.1Txで5分間、少なくとも3回洗浄します。 直接TRAP染色(最良のアプローチ)に移行するか、PBS-0.1 Txで一晩保存します。 鱗屑のTRAP染色を行います。PBS-0.1 Tx溶液を除去し、比色TRAPワーキング溶液(ステップ5.2.1)を加えて、サンプルを完全に覆います(つまり、1.5 mLの微量遠心チューブに1 mL)。 RTで1〜2時間インキュベートし、暗闇で揺れます。 染色液を除去し、PBS-0.1 Twで5分間以上3回洗浄してください。 サンプルを 4% PFA で 30 分間室温で後固定し、暗所で静かに揺動させます。 PBS-0.1 Twで各工程5分間3回洗浄し、PFA溶液を除去する。注:サンプルは、暗所で4°Cで無期限に保管できます(保存溶液中/顕微鏡スライドに取り付けます)。 6. ステンドスケールの取り付け 2.4gのMowiol 4-88結晶を6gのグリセロールに添加して封入剤を調製します( 材料表を参照)。任意の好ましい封入媒体を使用することができる。 6 mLの脱イオン水を加え、マグネチックスターラーに1時間放置します。 12 mLの0.2 Mトリス(pH 8.5)を加え、Mowiol結晶が完全に溶解するまで約53°Cでインキュベートします。 室温で2000 x g で20分間遠心分離することにより、溶液を清澄化します。 溶液を保管容器に移します。封入剤は冷凍庫で約12ヶ月間保管できます。解凍したMowiol溶液は、最大1か月間安定しています。 培地に体重計を顕微鏡スライドに取り付け、カバーガラスで覆い、顕微鏡で観察します。 7. 鱗の 生体外 培養 注:このステップは、de Vrieze et al.12から引用しています。 無菌環境で鱗屑を採取する前に、骨形成培地と培養プレートを準備します。骨形成培養培地(OCM):滅菌遠心チューブ内で、1%ウシ血清、1%(0.85%NaCl中の200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチド)、1%抗生物質/抗真菌剤溶液(100x)溶液、4 mM CaCl2、10 mM β-グリセロリン酸、1 nMピルビン酸ナトリウム、および1%アムホテリシンB(オプション)の最終濃度で、標準的な細胞培養培地(高グルコース、グルタミンなし、フェノールレッドなし)で15 mLのOCMを調製します( 材料表を参照)。 OCMを滅菌試薬リザーバーに流し込み、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートの各ウェルに100 μLを添加します。 96ウェルプレートを密封し、プレートを保管します。OCMは冷蔵庫で短期間(一晩から1週間)保存し、使用前に28°Cに保つことができます。 スケールハーベスティングとPBS洗浄を行います。滅菌ピンセット/鉗子を使用して鱗を採取し、滅菌PBS溶液を含むペトリ皿に入れます。 プレートのセットアップを実行します。滅菌鉗子を使用して、100 μLのOCM(28°Cに加温)でペトリ皿から96ウェルプレート上の各ウェルに各スケールを移します。 すべてのスケールがプレートに移されたら、プレートを実体顕微鏡下に持ち込みます。微細な滅菌ピペットチップを使用して、各スケールをウェルの底に静かに移動させ、ウェルの側面から遠ざけて、画像取得中の光の反射を防ぎます。メモ: この手順は、ライブイメージングを実行する場合にのみ必要です。 プレートをインキュベーターまたはライブイメージングシステム(LIS、 材料表を参照)(28°C、5%CO2に設定)に慎重に移し、スケールを最大7日間培養します。 OCMをリフレッシュします(オプション)。冷蔵庫で保管していたOCMを28°Cに温める。 96ウェルプレートを無菌環境に慎重に移します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから50μLを吸引します。このためには、先端を壁に押し付け、スケールを吸引/移動/除去しないように、底まで浸さないでください。さまざまな条件で新しいヒントを使用します。 OCMを滅菌試薬リザーバーに注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに60 μLのOCMを加えます。 プレートを実体顕微鏡の下に置き、スケールの位置が間違っていないか(壁に近すぎる、浮いている、またはメディア内の垂直位置にある)を確認します。必要に応じて、無菌の細いピペットチップで再配置します。 プレートをインキュベーター/LISに戻します。注:実験に概日リズム(CR)が含まれる場合は、血清ショックが体内時計に影響を与える可能性があるため、培地を更新しないでください。CRを研究する場合は、光の状態も時計をリセットすることに注意します。 培養後のスケール染色とイメージングを行います(オプション)。6日間の培養後、それらを固定し、上記のvon KossaやALPなどの適切な染色に指示します。 あるいは、実験魚に蛍光タグが付いている場合は、プレートをライブイメージングシステムに入れます。注:ライブイメージングシステムを使用する場合は、実験に適した温度とCO2 レベルに設定されていることを確認してください。通常、この研究では、28°Cおよび5%CO2 を使用しました。適切なフィルターとイメージングのタイムポイント(ここでは、骨芽細胞の移動を追跡するのに十分な2時間または4時間の間隔を使用しました)および低倍率の対物レンズ(つまり、4倍)を選択して、ウェル全体のイメージングを均一に行えるようにします。これは、スケールがウェル内を移動する傾向があり、特に培地交換時に発生するためです。