Regeneração de Escamas de Zebrafish em Toto e Cultura Ex Vivo de Escamas

A Unidade Científica de Animais da Universidade (ASU) é responsável pelos cuidados com o peixe-zebra sob a orientação das diretrizes de criação de peixes-zebra. Todos os procedimentos, incluindo colheita de escala, coloração de ossos vivos e imagens ao vivo, foram aprovados e realizados sob uma Licença de Projeto do Ministério do Interior do Reino Unido (PP4700996). Para este manuscrito, foram utilizados zebrafish transgênicos adultos jovens da linhagem sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46]17. Os peixes incluíram machos e fêmeas de 4 meses de idade. 1. Regeneração em escala in vivo Antes de iniciar o experimento de regeneração em escala, transfira peixes-zebra de seus tanques principais para tanques individuais (ver Tabela de Materiais) e retorne a esses tanques individuais após a obtenção de imagens durante todo o experimento, como mostrado na Figura 2. Isso é para garantir que todas as escalas regeneradoras sejam aquelas colhidas para o experimento; O alojamento em grupo pode levar à perda esporádica de escamas devido a lesões causadas por outros peixes.NOTA: Os peixes são colocados individualmente para evitar combates e subsequente perda de escamas entre os peixes. Registrar as informações de cada peixe do experimento (ou seja, genótipo, idade e sexo) de acordo com o desenho do experimento. Use uma câmera (as câmeras do smartphone funcionam bem) para tirar uma imagem de cada peixe ao lado de uma régua para registrar o tamanho/comprimento do peixe e a condição de saúde. No dia do experimento, anestesiar o peixe-zebra usando 0,05% (v/v) de metano sulfonato de tricaína (MS222, ver Tabela de Materiais) por imersão e, em seguida, colocá-lo em uma placa de Petri com um tecido úmido para evitar o movimento do peixe durante a imagem ou a colheita. Coloque o peixe de lado (normalmente o flanco esquerdo é usado aqui para consistência). Realizar imagens de flanco usando um estereomicroscópio com aumento apropriado (normalmente, 2x, 4x e/ou 6,3x e 8x foram usados para o presente estudo para capturar tanto a área de regeneração geral quanto a área ampliada para observação detalhada).NOTA: Os tempos de imagem do flanco dependem do propósito experimental e da escolha dos repórteres transgênicos. Por exemplo, para rastrear osteoblastos durante a regeneração de escamas, os tempos sugeridos são Dia 0 (ontogenético), 2 dias pós-colheita (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Para reduzir os efeitos da anestesia repetida, mantenha os tempos de imagem no menor número necessário para o experimento. Colher escamas utilizando pinça fina e pinça sob estereomicroscópio. Transfira as escamas colhidas para tubos de coleta para posterior coloração das escamas.NOTA: O número máximo de escalas que podem ser colhidas dependerá das aprovações éticas locais que estão em vigor. Normalmente, colhemos cerca de 20 a 30 escamas e as coletamos em tubos de coleta individuais para coloração posterior das escamas, como ALP, von Kossa14. Coletar as escamas em um tubo de coleta de 1,5 mL ou 2 mL. Isso depende da técnica de coloração utilizada.Para a coloração de ALP e von Kossa, transferir as escamas para tubos de coleta contendo água deionizada, enquanto para coloração com TRAP ou imunohistoquímica, transferir as escamas para tubos de coleta contendo PFA (solução fixadora) a 4%. Opcional: Antes de transferir balanças para tubos, capture imagens de escalas colhidas individualmente, se necessário.NOTA: Os períodos de colheita das escalas sugeridas são o dia 0 (ontogenética), o dia 10 e o dia 21 (escalas regeneradas). 2. Coloração óssea viva NOTA: A coloração esquelética viva pode ser realizada quando os peixes experimentais não são transgênicos para repórteres fluorescentes ou quando carregam repórteres transgênicos de cor única. A coloração viva pode ser usada para complementar os transgênicos; por exemplo, pode-se usar um repórter de osteoblastos como sp7/osx em uma cor (por exemplo, GFP) e, em seguida, manchar o osso em vermelho com vermelho de alizarina (AR). AR e calceína verde podem ser usados para os mesmos peixes juntos; nesse cenário, o RA é usado para rotular o osso original ou ontogenético, ligando-se à matriz mineralizada do osso envelhecido, e a calceína liga-se aos íons cálcio que são abundantes no osso neoformado. Por exemplo, ao colorir uma escala ontogenética, o RA pode ser visualizado, mas o verde de calceína pode estar ausente ou mínimo, uma vez que as escalas ontogenéticas apresentam baixos níveis de formação óssea nova. Realizar coloração ao vivo de Alizarin Red (AR).Preparar um frasco de solução corante de 2x AR misturando solução de alizarina a 0,5% (p/v) (10 mL) com 10 mL de HEPES estoque 1 M (concentração final, 10 mM) (ver Tabela de Materiais). Remate até 1 L com 1x solução de Danieau (ver Tabela de Materiais). A solução deve ser mantida no escuro ou envolvida com papel alumínio. No dia do experimento, levar 500 mL de solução de RA 2x para a instalação de peixe-zebra e adicionar 500 mL de água do sistema (do aquário) para fazer 1x solução de RA funcional. Transfira os peixes de seus tanques para uma solução de coloração de RA de trabalho de 1x e deixe por 15-20 min. Lave o excesso de manchas nos peixes com 15 minutos de ‘lavagem’ na água do sistema. Realize a coloração verde Calcein ao vivo.Preparar um frasco de 2x Calcein Green solução corante adicionando 45 mg de Calcein pó em 900 mL de 1x solução de Danieau (ver Tabela de Materiais). Use um agitador magnético para permitir que o pó se dissolva completamente. Ajuste o pH para 8. Esta é a solução Calcein Green de estoque 2x. A solução pode ser armazenada no escuro/embrulhada com papel alumínio por até 1 mês. No dia do experimento, levar 500 mL de solução de 2x Calcein Green para a instalação de zebrafish e adicionar 500 mL de água do sistema para fazer 1x solução de Calcein Green de trabalho. Recomenda-se o uso de solução de coloração de Calcein recém-feita. Transfira os peixes de seus tanques para 1x solução de coloração Calcein Green e deixe por 1-2 h. Dependendo do tamanho do peixe, um tempo de coloração maior pode ser necessário. Lave o excesso de manchas nos peixes por 15 minutos ‘lavando’ na água do sistema.NOTA: Imagem do peixe manchado de Calcein Green o mais rápido possível, pois esta mancha irá desaparecer em poucas horas. 3. Coloração de fosfatase alcalina (FA) em escamas pós-colheita Preparar a solução corante ALP misturando 100 mM Tris (pH 9,5 com HCl) com 100 mM NaCl e 50 mM MgCl2. Use a solução de estoque NBT/BCIP disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais). Transfira as balanças para tubos contendo água deionizada. Enxaguar as escamas em solução corante de ALP por 5 min. Enquanto isso, prepare uma solução corante de trabalho adicionando 200 μL da solução NBT/BCIP a 10 mL de tampão de coloração ALP. Isso precisa ser preparado na hora da coloração. Manchar as escamas com a solução corante ALP de trabalho por 15 min. Pare a reação enxaguando as escamas com água deionizada. 4. Coloração de von KOSSA em escamas pós-colheita Preparar solução de nitrato de prata a 5% (p/v). Preparar solução de tiossulfato de sódio a 5% (p/v). Transfira as escamas colhidas para tubos contendo água deionizada. Incubar as escamas na solução de nitrato de prata durante 40 minutos sob luz forte.OBS: Use EPIs (equipamentos de proteção individual), pois o nitrato de prata deixa uma mancha de difícil remoção. Lave as escamas duas vezes por 5 min com água deionizada.NOTA: Os resíduos de nitrato de prata devem ser recolhidos e eliminados de acordo com as orientações locais. Incubar as escamas em tiossulfato de sódio por 5 min. Lave as escamas duas vezes por 5 min com água deionizada. 5. Coloração colorimétrica TRAP NOTA: Para o procedimento detalhado, consulte o trabalho publicado anteriormente18. Prepare as soluções corantes.Preparar 10 mg/ml de solução de fosfato de naftol AS-MX.Pesar 5 mg de fosfato de naftol AS-MX (ver Tabela de Materiais). No exaustor, preparar um tubo com 0,5 ml de N, N’-dimetilformamida e dissolver 5 mg de fosfato de Naftol AS-MX em 0,5 ml de N, N’-dimetilformamida para fazer uma solução-mãe de 10 mg/ml de fosfato de Naftol AS-MX (agitar suavemente). Preparar 1,6 mM de solução-mãe Fast Red Violet LB em tartarato de sódio 50 mM.Preparar 50 mL de acetato de sódio 0,1 M em pH 5 (adicionar 0,41015 g de acetato de sódio em 50 mL de água deionizada e ajustar o pH para 5 com ácido acético a 100%). Dissolver 0,575 g de L-tartarato de sódio dibásico di-hidratado (ver Tabela de Materiais) em 50 ml de tampão acetato de sódio 0,1 M (pH = 5). Adicione 30 mg de sal LB violeta vermelho rápido. Preparar PBS-0,1Tx (dissolver 500 μL de Triton-X em 500 mL de PBS).Preparar PBS-0,1Tw (dissolver 500 μL de Tween-20 em 500 mL de PBS). Prepare uma solução TRAP em funcionamento.Misturar ambas as soluções-mãe no exaustor (0,5 ml de solução de fosfato de Naftol AS-MX 10 mg/ml e 50 ml de solução-mãe Fast Red Violet LB 1,6 mM em tartarato de sódio 50 mM).NOTA: A solução de trabalho agora pode ser usada fora do exaustor. Pode ser armazenado na geladeira (embrulhado em papel alumínio) por até um mês. Conservar em recipientes separados de anticorpos ou outros reagentes sensíveis a fixadores. Manter longe da luz tanto quanto possível. Opcional: preparar solução clareadora (em amostras pós-fixadas coradas com TRAP) em PBS e Tween-20 a 0,1% (PBS-0,1%Tw). Preparar uma mistura de concentração final de hidróxido de potássio a 0,5% (KOH) (a partir de solução-mãe a 10% (p/v)) e peróxido de hidrogénio a 3% (H2O2) (solução-mãe a 33%, armazenada no frigorífico). Realizar a fixação da amostra.Fixar escalas em PFA 4% em 1x PBS balançando ou girando por 40 min à temperatura ambiente (TR). Retire o PFA a 4% e lave com PBS-0.1Tx pelo menos 3 vezes durante 5 min cada lavagem. Passe diretamente para a coloração TRAP (a melhor abordagem) ou armazene em PBS-0.1 Tx durante a noite. Realizar coloração TRAP das escamas.Remover a solução PBS-0,1 Tx e adicionar a solução colorimétrica de trabalho TRAP (passo 5.2.1) para cobrir totalmente as amostras (ou seja, 1 ml num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml). Incubar por 1-2 h no TR, balançando no escuro. Retire a solução corante e lave pelo menos 3 vezes com PBS-0,1 Tw durante 5 min cada lavagem. Pós-fixar as amostras em PFA 4% por 30 min em RT, balançando suavemente no escuro. Retire a solução de PFA lavando 3 vezes com PBS-0,1 Tw durante 5 min em cada passo.NOTA: As amostras podem ser armazenadas (em soluções de armazenamento/montadas em lâminas de microscópio) a 4 °C no escuro indefinidamente. 6. Montagem de escamas coradas Prepare o meio de montagem adicionando 2,4 g de cristais de Mowiol 4-88 a 6 g de glicerol (ver Tabela de Materiais). Qualquer mídia de montagem preferida pode ser usada. Adicione 6 mL de água deionizada e deixe em um agitador magnético por uma hora. Adicionar 12 mL de Tris 0,2 M (pH 8,5) e incubar a aproximadamente 53°C até que os cristais de Mowiol se dissolvam completamente. Clarificar a solução centrifugando a 2000 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente. Transfira a solução para um contêiner de armazenamento. O meio de montagem pode ser mantido no congelador por cerca de 12 meses. A solução de Mowiol descongelada é estável por até 1 mês. Monte as escamas em uma lâmina de microscópio na montagem do meio, cubra-as com uma lamínula e visualize-as sob um microscópio. 7. Cultura ex vivo de balanças NOTA: Esta etapa é adaptada de de Vrieze et al.12. Antes de colher as escamas em ambiente estéril, prepare o meio osteogênico e a placa de cultura.Meio de cultura osteogênico (OCM): Em um tubo centrífugo estéril, fazer 15 mL de OCM em meio de cultura celular padrão (glicose alta, sem glutamina, sem vermelho fenol) nas concentrações finais de 1% de soro bovino de bezerro, 1% (200 mM de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina em NaCl a 0,85%), solução de antibiótico/antimicótico a 1% (100x), CaCl2 4 mM, β-glicerofosfato 10 mM, piruvato de sódio 1 nM e anfotericina B a 1% (opcional) (ver Tabela de Materiais). Despeje o OCM em um reservatório de reagente estéril e, usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL a cada poço da placa de 96 poços. Sele a placa de 96 poços e guarde a placa. O OCM pode ser armazenado na geladeira por um curto período (durante a noite até 1 semana) e mantido a 28 °C antes do uso. Realizar colheita em escala e lavagem em PBS.Colher as escamas com pinças/pinças estéreis e depositá-las em uma placa de Petri contendo uma solução estéril de PBS. Execute a configuração da placa.Transfira cada escala da placa de Petri para cada poço na placa de 96 poços com 100 μL de OCM (aquecido a 28 °C) usando pinça estéril. Uma vez que todas as escamas são transferidas para a placa, traga a placa sob um estereomicroscópio. Usando uma ponta de pipeta fina e estéril para mover suavemente cada escala para o fundo do poço e mantê-las longe do lado dos poços para evitar a reflexão da luz durante a aquisição da imagem.Observação : esta etapa é necessária somente se estiver executando imagens ao vivo. Transfira cuidadosamente a placa para a incubadora ou para o Live Imaging System (LIS, ver Tabela de Materiais) (definido a 28 °C, 5% CO2), onde as escamas podem ser cultivadas por até 7 dias. Atualizar OCM (opcional).Aqueça o OCM que foi armazenado na geladeira a 28 °C. Transfira cuidadosamente a placa de 96 poços para um ambiente estéril. Usando uma pipeta multicanal, aspirar 50 μL de cada poço. Para isso, pressione as pontas contra as paredes e não as mergulhe até o fundo para evitar aspirar/mover/remover as escamas. Use novas dicas para diferentes condições. Despeje o OCM em um reservatório de reagente estéril e, usando a pipeta multicanal, adicione 60 μL de OCM a cada poço. Coloque a placa sob o estereomicroscópio e verifique se há escamas mal posicionadas (muito próximas das paredes, flutuando ou em posição vertical dentro da mídia). Reposicione-os com uma ponta de pipeta fina e estéril, se necessário. Coloque a placa de volta na incubadora/LIS.NOTA: Não atualize o meio se o experimento envolver ritmo circadiano (RC), pois o choque sérico pode afetar o relógio biológico. Observe se estudar CR observa que as condições de luz também redefinir o relógio. Realizar coloração e aquisição de imagens em escala pós-cultura (opcional).Após 6 dias de cultura, fixá-los e direcioná-los para coloração apropriada como von Kossa e ALP mencionados acima. Alternativamente, se os peixes experimentais tiverem uma etiqueta fluorescente, coloque a placa em um sistema de imagem ao vivo.NOTA: Se estiver usando um sistema de imagem ao vivo, certifique-se de que ele esteja definido para uma temperatura e nível de CO2 apropriados para o experimento. Tipicamente, neste estudo, foram utilizados 28 °C e 5% de CO2 . Selecione filtros e tempos de imagem apropriados (aqui, um intervalo de 2 ou 4 h, que é suficiente para acompanhar a migração de osteoblastos, foi usado) e objetivas de baixa magnificação (ou seja, 4x) para garantir imagens uniformes de todos os poços. Isso ocorre porque as escamas tendem a se mover dentro dos poços, particularmente durante as mudanças de meio.