Rigenerazione delle squame di zebrafish in toto e cultura delle squame ex vivo

L’Unità Scientifica Universitaria per gli Animali (ASU) è responsabile della cura del pesce zebra sotto la guida delle linee guida per l’allevamento del pesce zebra. Tutte le procedure, tra cui la raccolta delle incrostazioni, la colorazione delle ossa vive e l’imaging dal vivo, sono state approvate ed eseguite con una licenza di progetto del Ministero degli Interni del Regno Unito (PP4700996). Per questo manoscritto è stato utilizzato un pesce zebra transgenico giovane adulto della linea sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46]17. Il pesce comprendeva sia maschi che femmine di 4 mesi. 1. Rigenerazione su scala in vivo Prima di iniziare l’esperimento di rigenerazione delle incrostazioni, trasferire i pesci zebra dalle loro vasche principali alle vasche individuali (vedere la tabella dei materiali) e tornare a queste singole vasche dopo l’imaging durante l’esperimento, come mostrato nella Figura 2. Questo per garantire che tutte le scaglie rigeneranti siano quelle raccolte per l’esperimento; L’alloggio in gruppo può portare a una sporadica perdita di squame a causa di lesioni causate da altri pesci.NOTA: I pesci sono posizionati singolarmente per evitare combattimenti e la successiva perdita di squame tra i pesci. Registrare le informazioni per ogni pesce dell’esperimento (ad esempio, genotipo, età e sesso) in base al disegno dell’esperimento. Usa una fotocamera (le fotocamere degli smartphone funzionano bene) per scattare un’immagine di ogni pesce accanto a un righello per registrare le dimensioni/lunghezza e le condizioni di salute del pesce. Il giorno dell’esperimento, anestetizzare il pesce zebra utilizzando tricaina metano solfonato allo 0,05% (v/v) (MS222, vedi Tabella dei materiali) per immersione, quindi posizionarlo su una capsula di Petri con un tessuto umido per evitare il movimento del pesce durante l’imaging o la raccolta. Posiziona il pesce su un lato (in genere qui viene utilizzato il fianco sinistro per coerenza). Eseguire l’imaging del fianco utilizzando uno stereomicroscopio con un ingrandimento appropriato (tipicamente, 2x, 4x e/o 6,3x e 8x sono stati utilizzati per il presente studio per catturare sia l’area di rigenerazione complessiva che l’area ingrandita per un’osservazione dettagliata).NOTA: I timepoint dell’imaging del fianco dipendono dallo scopo sperimentale e dalla scelta dei reporter transgenici. Ad esempio, per monitorare gli osteoblasti durante la rigenerazione delle incrostazioni, i punti temporali suggeriti sono Giorno 0 (ontogenetico), 2 giorni dopo il prelievo (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Per ridurre gli effetti dell’anestesia ripetuta, mantenere i timepoint di imaging al minimo richiesto per l’esperimento. Raccogli le scaglie usando pinzette sottili e pinze sotto lo stereomicroscopio. Trasferire le squame raccolte in provette di raccolta per la successiva colorazione delle incrostazioni.NOTA: Il numero massimo di scaglie che possono essere raccolte dipenderà dalle approvazioni etiche locali in vigore. In genere raccogliamo da 20 a 30 cocciniglie e le raccogliamo in singole provette di raccolta per la successiva colorazione delle cocciniglie, come ALP, von Kossa14. Raccogliere le squame in una provetta di raccolta da 1,5 mL o 2 mL. Questo dipende dalla tecnica di colorazione utilizzata.Sia per la colorazione ALP che per la colorazione di von Kossa, trasferire le incrostazioni in provette di raccolta contenenti acqua deionizzata, mentre per la colorazione TRAP o l’immunoistochimica, trasferire le incrostazioni in provette di raccolta contenenti il 4% di PFA (soluzione di fissaggio). Opzionale: prima di trasferire le squame nelle provette, acquisire immagini delle singole scaglie raccolte, se necessario.NOTA: I punti temporali suggeriti per la raccolta delle cocciniglie sono il giorno 0 (ontogenetico), il giorno 10 e il giorno 21 (cocciniglie rigenerate). 2. Colorazione dell’osso vivo NOTA: La colorazione scheletrica viva può essere eseguita sia quando i pesci da esperimento non sono transgenici per i reporter fluorescenti sia quando trasportano reporter transgenici monocolore. La colorazione viva può essere utilizzata per integrare i transgenici; ad esempio, si potrebbe usare un reporter per osteoblasti come sp7/osx in un colore (ad esempio, GFP), quindi colorare l’osso in rosso con il rosso di alizarina (AR). AR e calceina verde possono essere utilizzati per lo stesso pesce insieme; in questo scenario, l’AR viene utilizzato per marcare l’osso originale o ontogenetico legandosi alla matrice mineralizzata dell’osso invecchiato e la calceina si lega agli ioni calcio che sono abbondanti nell’osso di nuova formazione. Ad esempio, quando si colora una scala ontogenetica, l’AR può essere visualizzata, ma il verde calceina può essere assente o minimo poiché le scale ontogenetiche hanno bassi livelli di formazione di nuovo osso. Eseguire la colorazione dal vivo con Alizarin Red (AR).Preparare un flacone di 2 soluzioni coloranti AR mescolando una soluzione di alizarina allo 0,5% (p/v) (10 ml) con 10 mL di HEPES (concentrazione finale, 10 mM) (vedere la tabella dei materiali). Rabboccare fino a 1 L con 1x soluzione Danieau (vedi Tabella dei materiali). La soluzione deve essere conservata al buio o avvolta in un foglio. Il giorno dell’esperimento, portare 500 ml di soluzione AR 2x nella struttura zebrafish e aggiungere 500 ml di acqua di sistema (dall’acquario) per creare una soluzione AR funzionante. Trasferire i pesci dalle loro vasche in una soluzione colorante AR funzionante 1x e lasciare agire per 15-20 minuti. Lavare via la macchia in eccesso sul pesce con 15 minuti di “lavaggio” nell’acqua del sistema. Eseguire la colorazione dal vivo Calcein Green.Preparare un flacone di 2x soluzione colorante Calcein Green aggiungendo 45 mg di polvere di Calceina in 900 mL di 1x soluzione Danieau (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare un agitatore magnetico per consentire alla polvere di dissolversi completamente. Regolare il pH a 8. Questa è la soluzione Calcein Green 2x stock. La soluzione può essere conservata al buio/avvolta con un foglio per un massimo di 1 mese. Il giorno dell’esperimento, portare 500 ml di soluzione 2x Calcein Green nella struttura zebrafish e aggiungere 500 mL di acqua di sistema per fare 1x soluzione Calcein Green funzionante. Si consiglia di utilizzare una soluzione colorante di Calceina appena preparata. Trasferire i pesci dalle loro vasche in 1x soluzione colorante Calcein Green funzionante e lasciare agire per 1-2 ore. A seconda delle dimensioni del pesce, potrebbe essere necessario un tempo di colorazione più lungo. Lavare via la macchia in eccesso sul pesce entro 15 minuti di “lavaggio” nell’acqua del sistema.NOTA: Immagina il pesce macchiato di Calcein Green il prima possibile poiché questa macchia svanirà in poche ore. 3. Colorazione della fosfatasi alcalina (ALP) sulle squame dopo la raccolta Preparare la soluzione colorante ALP mescolando 100 mM Tris (pH 9,5 con HCl) con 100 mM di NaCl e 50 mM di MgCl2. Utilizzare una soluzione madre NBT/BCIP disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali). Trasferire le incrostazioni in provette contenenti acqua deionizzata. Sciacquare le squame in una soluzione colorante ALP per 5 minuti. Nel frattempo, preparare una soluzione colorante di lavoro aggiungendo 200 μL della soluzione NBT/BCIP a 10 mL di tampone colorante ALP. Questo deve essere preparato al momento della colorazione. Colorare le squame con la soluzione colorante ALP di lavoro per 15 min. Arrestare la reazione sciacquando le incrostazioni con acqua deionizzata. 4. Colorazione di Von KOSSA sulle squame dopo la raccolta Preparare una soluzione di nitrato d’argento al 5% (p/v). Preparare una soluzione di tiosolfato di sodio al 5% (p/v). Trasferire le scaglie raccolte in provette contenenti acqua deionizzata. Incubare le squame nella soluzione di nitrato d’argento per 40 minuti sotto una luce intensa.NOTA: Indossare i DPI (dispositivi di protezione individuale) poiché il nitrato d’argento lascia una macchia difficile da rimuovere. Lavare la bilancia due volte per 5 minuti con acqua deionizzata.NOTA: I rifiuti di nitrato d’argento devono essere raccolti e smaltiti secondo le linee guida locali. Incubare le squame nel tiosolfato di sodio per 5 min. Lavare la bilancia due volte per 5 minuti con acqua deionizzata. 5. Colorazione colorimetrica TRAP NOTA: Per la procedura dettagliata, si rimanda ai lavori pubblicati in precedenza18. Preparare le soluzioni coloranti.Preparare 10 mg/mL di soluzione di naftolo fosfato AS-MX.Pesare 5 mg di naftolo fosfato AS-MX (vedere la tabella dei materiali). Nella cappa aspirante, preparare una provetta con 0,5 mL di N, N’-dimetilformammide e sciogliere 5 mg di naftolo AS-MX fosfato in 0,5 mL di N, N’-dimetilformammide per ottenere una soluzione madre di 10 mg/mL di naftolo fosfato AS-MX (agitare delicatamente). Preparare 1,6 mM di soluzione madre Fast Red Violet LB in 50 mM di tartrato di sodio.Preparare 50 mL di acetato di sodio 0,1 M a pH 5 (aggiungere 0,41015 g di acetato di sodio in 50 mL di acqua deionizzata e regolare il pH a 5 con acido acetico al 100%). Sciogliere 0,575 g di L-tartrato di sodio bibasico diidrato (vedi tabella dei materiali) in 50 mL di tampone in acetato di sodio 0,1 M (pH = 5). Aggiungere 30 mg di sale rosso viola veloce LB. Preparare PBS-0.1Tx (sciogliere 500 μL di Triton-X in 500 mL di PBS).Preparare PBS-0.1Tw (sciogliere 500 μL di Tween-20 in 500 mL di PBS). Preparare una soluzione TRAP funzionante.Miscelare entrambe le soluzioni madre nella cappa aspirante (0,5 mL di soluzione fosfato AS-MX di naftolo 10 mg/mL e 50 mL di soluzione madre di 1,6 mM Fast Red Violet LB in 50 mM di tartrato di sodio).NOTA: La soluzione di lavoro può ora essere utilizzata all’esterno della cappa aspirante. Può essere conservato in frigorifero (avvolto in un foglio) per un massimo di un mese. Conservare in contenitori separati dagli anticorpi o da altri reagenti sensibili ai fissativi. Tenere il più possibile al riparo dalla luce. Facoltativo: preparare la soluzione sbiancante (su campioni post-fissati che sono stati colorati con TRAP) in PBS e 0,1% Tween-20 (PBS-0,1%Tw). Preparare una miscela di concentrazione finale di idrossido di potassio (KOH) allo 0,5% (da soluzione madre al 10% (p/v)) e perossido di idrogeno al 3% (H2O2 ) (soluzione madre al 33%, conservata in frigorifero). Eseguire la fissazione del campione.Fissare le scale in PFA al 4% in 1x PBS oscillando o ruotando per 40 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere il 4% di PFA e lavare con PBS-0.1Tx almeno 3 volte per 5 minuti ciascuno. Passare direttamente alla colorazione TRAP (l’approccio migliore) o conservare in PBS-0.1 Tx durante la notte. Eseguire la colorazione TRAP delle squame.Rimuovere la soluzione PBS-0.1 Tx e aggiungere la soluzione di lavoro colorimetrica TRAP (passaggio 5.2.1) per coprire completamente i campioni (ad esempio, 1 mL in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL). Incubare per 1-2 ore a RT, dondolando al buio. Rimuovere la soluzione colorante e lavare almeno 3 volte con PBS-0.1 Tw per 5 minuti ciascuno. Post-fissare i campioni in PFA al 4% per 30 minuti a RT, dondolando delicatamente al buio. Rimuovere la soluzione di PFA lavando 3 volte con PBS-0.1 Tw per 5 minuti ogni passaggio.NOTA: I campioni possono essere conservati (in soluzioni di conservazione/montati su vetrini da microscopio) a 4 °C al buio per un periodo indefinito. 6. Montaggio di bilance macchiate Preparare il mezzo di montaggio aggiungendo 2,4 g di cristalli Mowiol 4-88 a 6 g di glicerolo (vedere la tabella dei materiali). È possibile utilizzare qualsiasi supporto di montaggio preferito. Aggiungere 6 mL di acqua deionizzata e lasciare agire su un agitatore magnetico per un’ora. Aggiungere 12 mL di Tris 0,2 M (pH 8,5) e incubare a circa 53°C fino a quando i cristalli di Mowiol non si dissolvono completamente. Chiarificare la soluzione centrifugando a 2000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la soluzione in un contenitore di stoccaggio. Il mezzo di montaggio può essere conservato nel congelatore per circa 12 mesi. La soluzione Mowiol scongelata è stabile fino a 1 mese. Montare le bilance su un vetrino da microscopio montando il supporto, coprirle con un vetrino coprioggetto e visualizzarle al microscopio. 7. Coltura ex vivo delle squame NOTA: Questo passaggio è adattato da de Vrieze et al.12. Prima di raccogliere le squame in un ambiente sterile, preparare il terreno osteogenico e la piastra di coltura.Terreno di coltura osteogenico (OCM): in una provetta da centrifuga sterile, preparare 15 mL di OCM in terreno di coltura cellulare standard (alto contenuto di glucosio, senza glutammina, senza rosso fenolo) alle concentrazioni finali di 1% di siero di vitello bovino, 1% (200 mM di L-alanil-L-glutammina dipeptide in NaCl allo 0,85%), soluzione antibiotica/antimicotica all’1% (100x), 4 mM di CaCl2, 10 mM di β-glicerofosfato, 1 nM di piruvato di sodio e 1 % di amfotericina B (opzionale) (vedere la tabella dei materiali). Versare l’OCM in un serbatoio sterile per reagenti e, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 μL a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Sigillare la piastra a 96 pozzetti e conservare la piastra. L’OCM può essere conservato in frigorifero per un breve periodo (da una notte a 1 settimana) e conservato a 28 °C prima dell’uso. Eseguire la raccolta delle incrostazioni e il lavaggio PBS.Raccogliere le squame utilizzando pinzette/pinze sterili e depositarle in una capsula di Petri contenente una soluzione sterile di PBS. Eseguire l’impostazione della piastra.Trasferire ciascuna bilancia dalla capsula di Petri a ciascun pozzetto sulla piastra a 96 pozzetti con 100 μL di OCM (riscaldato a 28 °C) utilizzando una pinza sterile. Una volta che tutte le squame sono state trasferite sulla piastra, portare la piastra sotto uno stereomicroscopio. Utilizzando una punta di pipetta fine e sterile per spostare delicatamente ogni scala sul fondo del pozzetto e tenerla lontana dal lato dei pozzetti per evitare riflessi di luce durante l’acquisizione dell’immagine.NOTA: Questo passaggio è necessario solo se si esegue l’imaging dal vivo. Trasferire con cautela la piastra nell’incubatore o nel Live Imaging System (LIS, vedere la tabella dei materiali) (impostato a 28 °C, 5% CO2 ), dove le squame possono essere coltivate per un massimo di 7 giorni. Aggiorna OCM (facoltativo).Scaldare l’OCM conservato in frigorifero a 28 °C. Trasferire con cautela la piastra a 96 pozzetti in un ambiente sterile. Utilizzando una pipetta multicanale, aspirare 50 μL da ciascun pozzetto. Per questo, premere le punte contro le pareti e non immergerle fino al fondo per evitare di aspirare/spostare/rimuovere le squame. Usa nuovi suggerimenti per condizioni diverse. Versare l’OCM in un serbatoio sterile per reagenti e, utilizzando la pipetta multicanale, aggiungere 60 μL di OCM a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra sotto lo stereomicroscopio e verificare la presenza di squame fuori posto (troppo vicino alle pareti, fluttuante o in posizione verticale all’interno del supporto). Se necessario, riposizionarli con un puntale di pipetta fine e sterile. Riposizionare la piastra nell’incubatrice/LIS.NOTA: Non aggiornare il terreno se l’esperimento coinvolge il ritmo circadiano (CR), poiché lo shock sierico può influenzare l’orologio biologico. Nota: se si studia CR, si nota che le condizioni di luce azzerano anche l’orologio. Eseguire la colorazione e l’imaging delle incrostazioni post-colturali (opzionale).Dopo 6 giorni di coltura, fissarli e dirigerli per una colorazione appropriata come von Kossa e ALP di cui sopra. In alternativa, se i pesci sperimentali hanno un’etichetta fluorescente, inserire la piastra in un sistema di imaging dal vivo.NOTA: Se si utilizza un sistema di imaging dal vivo, assicurarsi che sia impostato su una temperatura e un livello di CO2 appropriati per l’esperimento. Tipicamente, in questo studio, sono stati utilizzati 28 °C e il 5% di CO2 . Selezionare i filtri e i timepoint di imaging appropriati (in questo caso è stato utilizzato un intervallo di 2 o 4 ore, sufficiente per seguire la migrazione degli osteoblasti) e gli obiettivi a basso ingrandimento (cioè 4x) per garantire un’immagine uniforme dell’intero pozzetto. Questo perché le bilance tendono a muoversi all’interno dei pozzetti, in particolare durante i cambi di fluido.