Регенерация чешуи данио-рерио in toto и ex vivo Культура чешуи

Университетский научный отдел животных (ASU) отвечает за уход за рыбками данио-рерио в соответствии с рекомендациями по разведению данио-рерио. Все процедуры, включая сбор зубного камня, окрашивание костей и визуализацию в реальном времени, были одобрены и выполнены в соответствии с проектной лицензией Министерства внутренних дел Великобритании (PP4700996). Для данной рукописи использовалась молодая особь трансгенной рыбки данио-рерио из линии sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46]17. Среди рыб были как самцы, так и самки в возрасте 4 месяцев. 1. Регенерация масштаба in vivo Перед началом эксперимента по регенерации щитовки пересадите рыбок данио-рерио из их основных аквариумов в отдельные резервуары (см. таблицу материалов) и вернитесь в эти индивидуальные резервуары после визуализации на протяжении всего эксперимента, как показано на рисунке 2. Это необходимо для того, чтобы гарантировать, что все регенерирующие чешуйки являются теми, которые были собраны для эксперимента; Групповое содержание может привести к спорадической потере чешуи из-за травм, нанесенных другими рыбами.ПРИМЕЧАНИЕ: Рыбы размещаются по отдельности, чтобы избежать драки и последующей потери чешуи между рыбами. Запишите информацию о каждой экспериментальной рыбе (т.е. генотип, возраст и пол) в соответствии с планом эксперимента. Используйте камеру (камеры смартфона работают нормально), чтобы сделать снимок каждой рыбы рядом с линейкой, чтобы записать размер/длину рыбы и состояние здоровья. В день эксперимента обезболивайте рыбок данио, используя 0,05% (v/v) трикаина метана сульфоната (MS222, см. таблицу материалов) путем погружения, затем поместите его на чашку Петри с влажной тканью, чтобы избежать движения рыбы во время визуализации или вылова. Положите рыбу на бок (обычно здесь используется левый бок для консистенции). Выполните визуализацию боковых поверхностей с помощью стереомикроскопа с соответствующим увеличением (как правило, в настоящем исследовании использовались 2x, 4x и/или 6,3x и 8x, чтобы захватить как общую регенерирующую область, так и увеличенную область для детального наблюдения).ПРИМЕЧАНИЕ: Временные точки визуализации боковых поверхностей зависят от цели эксперимента и выбора трансгенных репортеров. Например, для отслеживания остеобластов во время регенерации накипи рекомендуемые временные точки: день 0 (онтогенетический), 2 дня после сбора урожая (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Чтобы уменьшить эффект от повторной анестезии, используйте минимальное количество времени визуализации, необходимое для эксперимента. Соберите чешуйки с помощью тонкого пинцета и щипцов под стереомикроскопом. Переложите собранные чешуйки в сборные пробирки для последующего окрашивания накипи.ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное количество чешуек, которые могут быть собраны, будет зависеть от местных этических разрешений. Обычно мы собираем от 20 до 30 чешуек и собираем их в отдельные пробирки для последующего окрашивания накипи, например, ALP, von Kossa14. Соберите чешуйки в пробирку объемом 1,5 мл или 2 мл. Это зависит от используемой техники окрашивания.Как для окрашивания ЩФ, так и для окрашивания по Коссе переносят чешуйки в пробирки для сбора, содержащие деионизированную воду, тогда как для окрашивания TRAP или иммуногистохимии переносят чешуйки в пробирки для сбора, содержащие 4% PFA (фиксирующий раствор). Опционально: Перед переносом весов в пробирки при необходимости сделайте снимки отдельных собранных чешуек.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые временные точки сбора чешуи: день 0 (онтогенетический), день 10 и день 21 (регенерированные чешуйки). 2. Живое окрашивание костей ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание живых скелетов может быть выполнено либо в том случае, если экспериментальные рыбы не являются трансгенными для флуоресцентных репортеров, либо при ношении одноцветных трансгенных репортеров. Живое окрашивание может быть использовано в качестве дополнения к трансгенным препаратам; Например, можно использовать репортёр остеобластов, такой как SP7/OSX , в одном цвете (например, GFP), а затем окрасить кость в красный цвет ализариновым красным (AR). AR и кальцеин зеленый можно использовать для одной и той же рыбы вместе; В этом сценарии AR используется для мечения исходной или онтогенетической кости путем связывания с минерализованным матриксом старой кости, а кальцеин связывается с ионами кальция, которые в изобилии содержатся во вновь сформированной кости. Например, при окрашивании онтогенетической шкалы можно визуализировать АР, но кальцеиновый зеленый может отсутствовать или быть минимальным, так как онтогенетические чешуйки имеют низкий уровень образования новой костной ткани. Окрашивание ализариновым красным (AR) в прямом эфире.Приготовьте флакон 2x раствора для окрашивания AR, смешав 0,5% (по массе) исходный раствор ализарина (10 мл) с 10 мл 1 M стока HEPES (конечная концентрация, 10 мМ) (см. таблицу материалов). Долейте до 1 л 1x раствора Danieau (см. Таблицу материалов). Раствор необходимо хранить в темноте или обернуть пленкой. В день эксперимента принесите 500 мл 2-кратного раствора AR в помещение для рыбок данио-рерио и добавьте 500 мл системной воды (из аквариума), чтобы получить 1 рабочий раствор AR. Переложите рыб из аквариума в 1x рабочий раствор для окрашивания AR и оставьте на 15-20 минут. Смойте излишки пятна на рыбе 15-минутной «стиркой» в системной воде. Выполните живое окрашивание Calcein Green.Приготовьте флакон 2x раствора для окрашивания Calcein Green, добавив 45 мг порошка кальцеина в 900 мл 1x раствора Danieau (см. Таблицу материалов). Используйте магнитную мешалку, чтобы порошок полностью растворился. Отрегулируйте pH до 8. Это 2-кратный стоковый раствор Calcein Green. Раствор можно хранить в темноте/обернутом фольгой до 1 месяца. В день эксперимента принесите 500 мл 2x раствора Calcein Green на ферму по выращиванию рыбок данио и добавьте 500 мл системной воды, чтобы получить 1x рабочий раствор Calcein Green. Рекомендуется использовать свежеприготовленный раствор для окрашивания Calcein. Пересадите рыб из аквариумов в 1-кратный рабочий раствор для окрашивания Calcein Green и оставьте на 1-2 часа. В зависимости от размера рыбы может потребоваться более длительное время окрашивания. Смойте излишки пятна на рыбе 15-минутной «стиркой» в системной воде.ПРИМЕЧАНИЕ: Как можно скорее изобразите рыбу, окрашенную в зеленый цвет Calcein, так как это пятно исчезнет через несколько часов. 3. Окрашивание щелочной фосфатазой (ЩФ) чешуи после сбора урожая Приготовьте раствор для окрашивания ЩФ, смешав 100 мМ Tris (рН 9,5 с HCl) со 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl2. Используйте имеющееся в продаже решение NBT/BCIP (см. Таблицу материалов). Переложите весы в пробирки с деионизированной водой. Промыть чешуйки в растворе для окрашивания ALP в течение 5 мин. Тем временем приготовьте рабочий раствор для окрашивания, добавив 200 мкл раствора NBT/BCIP к 10 мл буфера для окрашивания ЩФ. Это нужно свежеприготовленное в момент окрашивания. Окрашивайте чешуйки рабочим раствором для окрашивания ЩФ в течение 15 мин. Остановите реакцию, промыв чешуйки деионизированной водой. 4. Окрашивание по Фон Коссе на чешуйках после сбора урожая Приготовьте 5% раствор нитрата серебра. Приготовьте 5% (по массе) раствор тиосульфата натрия. Переложите собранные чешуйки в пробирки с деионизированной водой. Инкубируйте чешую в растворе нитрата серебра в течение 40 мин при сильном освещении.ПРИМЕЧАНИЕ: Носите СИЗ (средства индивидуальной защиты), так как нитрат серебра оставляет пятно, которое трудно удалить. Промойте чешую дважды в течение 5 минут деионизированной водой.ПРИМЕЧАНИЕ: Отходы нитрата серебра должны собираться и утилизироваться в соответствии с местными правилами. Инкубируйте чешую в тиосульфате натрия в течение 5 мин. Промойте чешую дважды в течение 5 минут деионизированной водой. 5. Колориметрическое окрашивание TRAP ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре, пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованной работе18. Приготовьте красящие растворы.Приготовьте раствор фосфата Нафтол АС-МХ в дозе 10 мг/мл.Взвесьте 5 мг фосфата нафтола AS-MX (см. таблицу материалов). В вытяжном шкафу приготовьте пробирку с 0,5 мл N, N’-диметилформамида и растворите 5 мг фосфата Нафтола АС-МХ в 0,5 мл N, N’-диметилформамида до получения исходного раствора 10 мг/мл фосфата Нафтола АС-МХ (осторожно встряхните). Приготовьте 1,6 мМ исходного раствора Fast Red Violet LB в 50 мМ тартрата натрия.Приготовьте 50 мл 0,1 М ацетата натрия при рН 5 (добавьте 0,41015 г ацетата натрия в 50 мл деионизированной воды и доведите рН до 5 100% уксусной кислотой). Растворить 0,575 г двухосновного дигидрата L-тартрата натрия (см. таблицу материалов) в 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН = 5). Добавьте 30 мг быстрой красно-фиолетовой соли. Приготовьте PBS-0,1Tx (растворите 500 мкл Triton-X в 500 мл PBS).Приготовьте PBS-0,1Tw (растворите 500 мкл Tween-20 в 500 мл PBS). Приготовьте рабочий раствор TRAP.Смешайте оба исходных раствора в вытяжном шкафу (0,5 мл раствора фосфата Нафтола AS-MX 10 мг/мл и 50 мл исходного раствора Fast Red Violet LB объемом 1,6 мМ в тартрате натрия 50 мМ).ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор теперь можно использовать вне вытяжного шкафа. Его можно хранить в холодильнике (завернув в фольгу) до месяца. Хранят в отдельной таре от антител или других реагентов, чувствительных к фиксаторам. Держитесь как можно дальше от света. Дополнительно: приготовить отбеливающий раствор (на образцах, окрашенных TRAP) в PBS и 0,1% Tween-20 (PBS-0,1%Tw). Приготовьте окончательную концентрационную смесь из 0,5% гидроксида калия (KOH) (из 10% исходного раствора (w/v)) и 3% перекиси водорода (H2O2) (33% исходный раствор, хранящийся в холодильнике). Выполните фиксацию образца.Зафиксируйте весы в 4% PFA в 1x PBS, раскачивая или вращая в течение 40 минут при комнатной температуре (RT). Удалите 4% PFA и промойте PBS-0,1Tx не менее 3 раз в течение 5 минут при каждой стирке. Сразу переходите к окрашиванию TRAP (лучший подход) или храните в PBS-0.1 Tx на ночь. Выполните окрашивание чешуи методом TRAP.Удалите раствор PBS-0,1 Tx и добавьте колориметрический рабочий раствор TRAP (шаг 5.2.1), чтобы полностью покрыть образцы (т. е. 1 мл в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл). Выдерживают 1-2 ч при РТ, покачивая в темноте. Удалите раствор для окрашивания и промойте не менее 3 раз ПБС-0,1 ТВт в течение 5 мин при каждой стирке. После закрепления образцов в 4% PFA в течение 30 мин при RT, осторожно покачивая в темноте. Удалите раствор PFA, промыв 3 раза PBS-0,1 Tw в течение 5 мин на каждом этапе.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить (в растворах для хранения/устанавливать на предметные стекла микроскопа) при температуре 4 °C в темноте неограниченное время. 6. Монтаж окрашенных весов Приготовьте монтажную среду, добавив 2,4 г кристаллов Mowiol 4-88 к 6 г глицерина (см. таблицу материалов). Можно использовать любой предпочтительный монтажный носитель. Добавьте 6 мл деионизированной воды и оставьте на магнитной мешалке на час. Добавьте 12 мл 0,2 М Триса (pH 8,5) и инкубируйте примерно при 53 ° C до полного растворения кристаллов Mowiol. Осветляют раствор центрифугированием при 2000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре. Переложите раствор в емкость для хранения. Монтажную среду можно хранить в морозильной камере около 12 месяцев. Размороженный раствор Mowiol стабилен до 1 месяца. Установите весы на предметное стекло микроскопа в монтажной среде, накройте их покровным стеклом и рассмотрите под микроскопом. 7. Культура масштабов ex vivo ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг адаптирован из de Vrieze et al.12. Перед заготовкой чешуек в стерильной среде подготовьте остеогенную среду и культуральную пластину.Остеогенная питательная среда (OCM): В стерильной центрифужной пробирке вносят 15 мл OCM в стандартную клеточную культуральную среду (с высоким содержанием глюкозы, без глютамина, без фенолового красного) в конечных концентрациях 1% сыворотки крупного рогатого скота, 1% (200 мМ L-аланил-L-глутамина дипептида в 0,85% NaCl), 1% раствора антибиотика/антимикотика (100x), 4 мМ CaCl2, 10 мМ β-глицерофосфата, 1 нМ пирувата натрия и 1 % амфотерицина B (опционально) (см. таблицу материалов). Налейте OCM в стерильный резервуар с реагентом и с помощью многоканальной пипетки добавьте 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета. Закройте 96-луночную пластину и храните ее. OCM можно хранить в холодильнике в течение короткого периода времени (от ночи до 1 недели) и выдерживать температуру 28 °C перед использованием. Выполните сбор накипи и промывку PBS.Соберите чешуйки с помощью стерильного пинцета/щипцов и поместите их в чашку Петри, содержащую стерильный раствор PBS. Выполните настройку пластины.Перенесите каждую шкалу из чашки Петри в каждую лунку на 96-луночном планшете со 100 мкл OCM (нагретой до 28 °C) с помощью стерильных щипцов. После того, как все чешуйки будут перенесены на пластину, поднесите пластину под стереомикроскоп. Используйте тонкий стерильный наконечник пипетки, чтобы осторожно переместить каждую шкалу на дно лунки и держать их подальше от стенок лунок, чтобы избежать отражения света во время получения изображения.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требуется только при выполнении визуализации в реальном времени. Осторожно перенесите планшет в инкубатор или систему визуализации в реальном времени (ЛИС, см. Таблицу материалов) (установленную при температуре 28 °C, 5% CO2), где чешуйки можно культивировать в течение 7 дней. Обновите OCM (необязательно).Нагрейте OCM, хранившийся в холодильнике, до 28 °C. Осторожно перенесите 96-луночный планшет в стерильную среду. С помощью многоканальной пипетки отсасывайте по 50 мкл из каждой лунки. Для этого прижмите кончики к стенкам и не погружайте их до дна, чтобы избежать аспирации/перемещения/удаления чешуек. Используйте новые советы для разных условий. Залейте OCM в стерильный резервуар с реагентами и с помощью многоканальной пипетки добавьте 60 мкл OCM в каждую лунку. Поместите планшет под стереомикроскоп и проверьте, нет ли неправильно расположенных чешуек (слишком близко к стенкам, плавающих или в вертикальном положении в среде). При необходимости переместите их с помощью тонкого стерильного наконечника для пипетки. Поместите планшет обратно в инкубатор/ЛИС.ПРИМЕЧАНИЕ: Не обновляйте среду, если эксперимент включает в себя циркадный ритм (КР), так как сывороточный шок может повлиять на биологические часы. Обратите внимание, что при изучении CR заметят, что условия освещения также сбрасывают часы. Выполните посткультуральное окрашивание и визуализацию по шкале (необязательно).После 6 дней культивирования зафиксируйте их и направьте на соответствующее окрашивание, такое как Von Kossa и ALP, упомянутые выше. В качестве альтернативы, если у подопытных рыб есть флуоресцентная метка, поместите пластину в систему визуализации в реальном времени.ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете систему визуализации в реальном времени, убедитесь, что она настроена на температуру и уровеньCO2 , подходящие для эксперимента. Как правило, в этом исследовании использовали 28 °C и 5%CO2 . Выберите подходящие фильтры и временные точки визуализации (в данном случае использовался интервал в 2 или 4 ч, достаточный для отслеживания миграции остеобластов) и объективы с малым увеличением (т.е. 4x), чтобы обеспечить равномерное изображение всей лунки. Это связано с тем, что весы имеют тенденцию перемещаться внутри лунок, особенно при смене среды.