Régénération d’écailles de poisson-zèbre Culture d’écailles in toto et ex vivo

L’Unité scientifique animale de l’Université (ASU) est responsable des soins aux poissons-zèbres sous la direction des directives d’élevage des poissons-zèbres. Toutes les procédures, y compris le prélèvement de tartres, la coloration d’os vivants et l’imagerie en direct, ont été approuvées et effectuées dans le cadre d’une licence de projet du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni (PP4700996). Pour ce manuscrit, de jeunes poissons-zèbres transgéniques adultes de la lignée sp7 :mCherry [Tg(osterix :mCherry-NTR)pd46] ont été utilisés17. Les poissons comprenaient des mâles et des femelles âgés de 4 mois. 1. Régénération à l’échelle in vivo Avant de commencer l’expérience de régénération des écailles, transférez les poissons-zèbres de leurs bassins principaux dans des bassins individuels (voir le tableau des matériaux) et retournez dans ces bassins individuels en suivant l’imagerie tout au long de l’expérience, comme le montre la figure 2. Il s’agit de s’assurer que toutes les écailles régénératrices sont celles récoltées pour l’expérience ; Le logement en groupe peut entraîner une perte sporadique d’écailles en raison de blessures causées par d’autres poissons.REMARQUE : Les poissons sont placés individuellement pour éviter les combats et la perte d’écailles subséquente entre les poissons. Consigner l’information sur chaque poisson expérimental (c.-à-d. génotype, âge et sexe) selon le plan de l’expérience. Utilisez un appareil photo (les appareils photo des smartphones fonctionnent bien) pour prendre une image de chaque poisson à côté d’une règle afin d’enregistrer la taille/longueur et l’état de santé des poissons. Le jour de l’expérience, anesthésier le poisson-zèbre à l’aide de 0,05 % (v/v) de sulfonate de méthane de tricaïne (MS222, voir tableau des matériaux) par immersion, puis le placer sur une boîte de Pétri avec un tissu humide pour éviter le mouvement du poisson pendant l’imagerie ou la récolte. Placez le poisson sur le côté (généralement le flanc gauche est utilisé ici pour plus de cohérence). Effectuer une imagerie de flanc à l’aide d’un stéréomicroscope avec un grossissement approprié (en général, 2x, 4x et/ou 6,3x et 8x ont été utilisés pour la présente étude afin de capturer à la fois la zone de régénération globale et la zone agrandie pour une observation détaillée).NOTE : Les points temporels de l’imagerie de flanc dépendent de l’objectif expérimental et du choix des rapporteurs transgéniques. Par exemple, pour suivre les ostéoblastes pendant la régénération des cochenilles, les points de temps suggérés sont le jour 0 (ontogénétique), 2 jours après la récolte (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Pour réduire les effets de l’anesthésie répétée, limitez les points de temps d’imagerie au minimum requis pour l’expérience. Prélever des écailles à l’aide d’une pince fine et d’une pince sous le stéréomicroscope. Transférez les écailles récoltées dans des tubes de collecte pour la coloration ultérieure des tartres.REMARQUE : Le nombre maximal de cochenilles pouvant être récoltées dépendra des approbations éthiques locales en vigueur. Nous récoltons généralement environ 20 à 30 cochenilles et les collectons dans des tubes de collecte individuels pour une coloration ultérieure des cochenilles, comme ALP, von Kossa14. Recueillir les écailles dans un tube de collecte de 1,5 ml ou de 2 ml. Cela dépend de la technique de coloration utilisée.Pour la coloration ALP et von Kossa, transférez les écailles dans des tubes de collecte contenant de l’eau déminéralisée, tandis que pour la coloration TRAP ou l’immunohistochimie, transférez les écailles dans des tubes de collecte contenant 4% de PFA (solution de fixation). Facultatif : Avant de transférer les écailles dans les tubes, capturez des images de chaque écaille récoltée si nécessaire.REMARQUE : Les points temporels de récolte suggérés sont le jour 0 (ontogénétique), le jour 10 et le jour 21 (écailles régénérées). 2. Coloration osseuse vivante NOTA : La coloration des squelettes vivants peut être effectuée soit lorsque les poissons expérimentaux ne sont pas transgéniques pour les rapporteurs fluorescents, soit lorsqu’ils transportent des rapporteurs transgéniques unicolores. La coloration vivante peut être utilisée en complément des transgéniques ; par exemple, on peut utiliser un rapporteur d’ostéoblastes tel que sp7/osx dans une couleur (par exemple, GFP), puis colorer l’os en rouge avec du rouge d’alizarine (AR). L’AR et le vert de calcéine peuvent être utilisés pour le même poisson ensemble ; dans ce scénario, l’AR est utilisée pour marquer l’os d’origine ou ontogénétique en se liant à la matrice minéralisée de l’os âgé, et la calcéine se lie aux ions calcium qui sont abondants dans l’os nouvellement formé. Par exemple, lors de la coloration d’une échelle ontogénétique, l’AR peut être visualisé, mais le vert de calcéine peut être absent ou minime car les échelles ontogénétiques ont de faibles niveaux de formation de nouveaux os. Effectuer une coloration en direct au rouge d’alizarine (AR).Préparer un flacon de solution de coloration AR 2x en mélangeant une solution d’alizarine à 0,5 % (p/v) (10 mL) avec 10 mL de 1 M de HEPES (concentration finale, 10 mM) (voir le tableau des matériaux). Complétez jusqu’à 1 L avec 1x solution de Danieau (voir tableau des matériaux). La solution doit être conservée à l’abri de la lumière ou enveloppée de papier d’aluminium. Le jour de l’expérience, apportez 500 mL de solution AR 2x à l’installation de poisson-zèbre et ajoutez 500 mL d’eau du système (de l’aquarium) pour obtenir une solution AR 1x fonctionnelle. Transférez les poissons de leurs aquariums dans une solution de coloration AR 1x et laissez agir pendant 15 à 20 minutes. Lavez l’excès de tache sur le poisson avec 15 minutes de « lavage » dans l’eau du système. Effectuer une coloration en direct du vert calcéine.Préparer un flacon de 2x solution colorante Calcein Green en ajoutant 45 mg de poudre de Calcein dans 900 mL de solution 1x Danieau (voir le tableau des matériaux). Utilisez un agitateur magnétique pour permettre à la poudre de se dissoudre complètement. Ajustez le pH à 8. Il s’agit de la solution Calcein Green 2x stock. La solution peut être conservée dans l’obscurité / enveloppée dans du papier d’aluminium jusqu’à 1 mois. Le jour de l’expérience, apportez 500 mL de solution 2x Calcein Green à l’installation de poisson-zèbre et ajoutez 500 mL d’eau du système pour obtenir 1x solution Calcein Green fonctionnelle. Il est recommandé d’utiliser une solution de coloration Calcein fraîchement préparée. Transférez les poissons de leur aquarium dans 1x solution de coloration Calcein Green et laissez-les agir pendant 1 à 2 h. Selon la taille du poisson, un temps de coloration plus long peut être nécessaire. Lavez l’excès de tache sur le poisson en 15 minutes de « lavage » dans l’eau du système.REMARQUE : Imaginez le poisson taché de vert calcéine dès que possible car cette tache s’estompera en quelques heures. 3. Coloration de la phosphatase alcaline (ALP) sur les écailles après la récolte Préparez la solution de coloration ALP en mélangeant 100 mM de Tris (pH 9,5 avec HCl) avec 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl2. Utiliser une solution mère NBT/BCIP disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Transvasez les écailles dans des tubes contenant de l’eau déminéralisée. Rincez les écailles dans la solution de coloration ALP pendant 5 min. Entre-temps, préparez une solution de coloration fonctionnelle en ajoutant 200 μL de solution NBT/BCIP à 10 mL de tampon de coloration ALP. Celui-ci doit être fraîchement préparé au moment de la coloration. Colorez les écailles avec la solution de coloration ALP pendant 15 min. Arrêtez la réaction en rinçant les écailles avec de l’eau déminéralisée. 4. Coloration de Von KOSSA sur les écailles après la récolte Préparer une solution de nitrate d’argent à 5 % (p/v). Préparer une solution de thiosulfate de sodium à 5 % (p/v). Transférez les écailles récoltées dans des tubes contenant de l’eau déminéralisée. Incuber les écailles dans la solution de nitrate d’argent pendant 40 min sous une forte lumière.REMARQUE : Portez un EPI (équipement de protection individuelle) car le nitrate d’argent laisse une tache difficile à enlever. Lavez les écailles deux fois pendant 5 min avec de l’eau déminéralisée.REMARQUE : Les déchets de nitrate d’argent doivent être collectés et éliminés conformément aux directives locales. Incuber les écailles dans du thiosulfate de sodium pendant 5 min. Lavez les écailles deux fois pendant 5 min avec de l’eau déminéralisée. 5. Colorimétrie TRAP colorimétrique NOTE : Pour la procédure détaillée, veuillez vous référer aux travaux publiés précédemment18. Préparez les solutions de coloration.Préparer une solution de phosphate de naphtol AS-MX à 10 mg/mL.Peser 5 mg de phosphate de naphtol AS-MX (voir le tableau des matériaux). Dans la hotte, préparez un tube contenant 0,5 mL de N,N’-diméthylformamide et dissolvez 5 mg de phosphate de naphtol AS-MX dans 0,5 mL de N,5 mL de N,N,-diméthylformamide pour obtenir une solution mère de 10 mg/mL de phosphate de naphtol AS-MX (agiter doucement). Préparer 1,6 mM de solution mère Fast Red Violet LB dans 50 mM de tartrate de sodium.Préparez 50 mL d’acétate de sodium 0,1 M à pH 5 (ajouter 0,41015 g d’acétate de sodium dans 50 mL d’eau déminéralisée et ajuster le pH à 5 avec de l’acide acétique à 100 %). Dissoudre 0,575 g de L-tartrate de sodium dibasique dihydraté (voir le tableau des matériaux) dans 50 mL de tampon d’acétate de sodium 0,1 M (pH = 5). Ajouter 30 mg de sel LB violet rouge rapide. Préparer PBS-0.1Tx (dissoudre 500 μL de Triton-X dans 500 mL de PBS).Préparer PBS-0.1Tw (dissoudre 500 μL de Tween-20 dans 500 mL de PBS). Préparez une solution TRAP qui fonctionne.Mélanger les deux solutions mères dans la hotte (0,5 mL de solution de phosphate de naphtol AS-MX à 10 mg/mL et 50 mL de solution mère de 1,6 mM de Fast Red Violet LB dans 50 mM de tartrate de sodium).REMARQUE : La solution de travail peut maintenant être utilisée à l’extérieur de la hotte. Il peut être conservé au réfrigérateur (enveloppé dans du papier d’aluminium) jusqu’à un mois. Conserver dans des récipients séparés des anticorps ou d’autres réactifs sensibles aux fixateurs. Tenir à l’abri de la lumière autant que possible. Facultatif : préparer une solution de blanchiment (sur des échantillons post-fixés qui ont été colorés au TRAP) dans du PBS et 0,1 % Tween-20 (PBS-0,1 % Tw). Préparer un mélange de concentration finale composé de 0,5 % d’hydroxyde de potassium (KOH) (à partir d’une solution mère à 10 % (p/v)) et de peroxyde d’hydrogène à 3 % (H2O2) (solution mère à 33 %, conservée au réfrigérateur). Effectuez la fixation de l’échantillon.Fixez les échelles dans 4% PFA dans 1x PBS en les balançant ou en les faisant tourner pendant 40 min à température ambiante (RT). Retirez les 4 % de PFA et lavez avec PBS-0.1Tx au moins 3 fois pendant 5 min à chaque lavage. Passez directement à la coloration TRAP (la meilleure approche) ou stockez-la dans du PBS-0.1 Tx pendant la nuit. Effectuez la coloration des écailles par TRAP.Retirer la solution de PBS-0.1 Tx et ajouter la solution de travail colorimétrique TRAP (étape 5.2.1) pour recouvrir complètement les échantillons (c’est-à-dire 1 mL dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL). Incuber pendant 1 à 2 h à RT, en se balançant dans l’obscurité. Retirez la solution de teinture et lavez au moins 3 fois avec PBS-0.1 Tw pendant 5 min à chaque lavage. Post-fixez les échantillons dans du PFA à 4 % pendant 30 min à RT, en les balançant doucement dans l’obscurité. Retirez la solution de PFA en lavant 3 fois avec PBS-0.1 Tw pendant 5 min à chaque étape.REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés (dans des solutions de stockage/montés sur des lames de microscope) à 4 °C dans l’obscurité indéfiniment. 6. Montage des écailles tachées Préparez le support d’enrobage en ajoutant 2,4 g de cristaux Mowiol 4-88 à 6 g de glycérol (voir tableau des matériaux). N’importe quel support de montage préféré peut être utilisé. Ajouter 6 mL d’eau déminéralisée et laisser agir sur un agitateur magnétique pendant une heure. Ajouter 12 mL de 0,2 M Tris (pH 8,5) et incuber à environ 53 ° C jusqu’à ce que les cristaux de Mowiol se dissolvent complètement. Clarifier la solution en centrifugeant à 2000 x g pendant 20 min à température ambiante. Transférez la solution dans un récipient de stockage. Le support de montage peut être conservé au congélateur pendant environ 12 mois. La solution Mowiol décongelée est stable jusqu’à 1 mois. Montez les écailles sur une lame de microscope dans le montage du support, couvrez-les d’une lamelle et regardez-les au microscope. 7. Culture ex vivo des écailles NOTE : Cette étape est adaptée de de Vrieze et al.12. Avant de récolter les cochenilles dans un environnement stérile, préparez le milieu ostéogénique et la plaque de culture.Milieu de culture ostéogénique (OCM) : Dans un tube à centrifuger stérile, préparer 15 mL d’OCM dans un milieu de culture cellulaire standard (glucose élevé, sans glutamine, sans rouge de phénol) aux concentrations finales de 1 % de sérum de veau bovin, 1 % (200 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide dans 0,85 % de NaCl), 1 % de solution antibiotique/antimycosique (100x), 4 mM de CaCl2, 10 mM de β-glycérophosphate, 1 nM de pyruvate de sodium et 1 % d’amphotéricine B (facultatif) (voir le tableau des matériaux). Versez l’OCM dans un réservoir de réactif stérile et, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 μL dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Scellez la plaque à 96 puits et rangez-la. L’OCM peut être conservé au réfrigérateur pendant une courte période (une nuit à 1 semaine) et conservé à 28 °C avant utilisation. Effectuer la récolte des tartres et le lavage du PBS.Prélevez les écailles à l’aide d’une pince à épiler stérile et déposez-les dans une boîte de Pétri contenant une solution stérile de PBS. Effectuez la configuration de la plaque.Transférer chaque écaille de la boîte de Pétri dans chaque puits de la plaque à 96 puits avec 100 μL d’OCM (réchauffée à 28 °C) à l’aide d’une pince stérile. Une fois que toutes les écailles sont transférées sur la plaque, amenez-la sous un stéréomicroscope. À l’aide d’une pointe de pipette fine et stérile, déplacez doucement chaque écaille vers le fond du puits et éloignez-les du côté des puits afin d’éviter la réflexion de la lumière pendant l’acquisition de l’image.REMARQUE : Cette étape n’est requise que si vous effectuez des images en direct. Transférez délicatement la plaque dans l’incubateur ou le système d’imagerie en direct (LIS, voir tableau des matériaux) (réglé à 28 °C, 5 % de CO2), où les écailles peuvent être cultivées jusqu’à 7 jours. Actualiser OCM (facultatif).Réchauffez l’OCM qui a été conservé au réfrigérateur à 28 °C. Transférez délicatement la plaque à 96 puits dans un environnement stérile. À l’aide d’une pipette multicanaux, aspirer 50 μL de chaque puits. Pour cela, appuyez les pointes contre les parois et ne les trempez pas jusqu’au fond pour éviter d’aspirer/déplacer/enlever les écailles. Utilisez de nouveaux embouts pour différentes conditions. Versez l’OCM dans un réservoir de réactif stérile et, à l’aide de la pipette multicanal, ajoutez 60 μL d’OCM dans chaque puits. Placez la plaque sous le stéréomicroscope et vérifiez qu’il n’y a pas d’écailles mal placées (trop près des murs, flottantes ou en position verticale dans le support). Repositionnez-les à l’aide d’un embout de pipette fin et stérile si nécessaire. Replacez la plaque dans l’incubateur/LIS.REMARQUE : Ne rafraîchissez pas le milieu si l’expérience implique le rythme circadien (RC), car le choc sérique peut affecter l’horloge biologique. Notez que si vous étudiez CR, notez que les conditions d’éclairage réinitialisent également l’horloge. Effectuer une coloration et une imagerie à l’échelle post-culture (facultatif).Après 6 jours de culture, fixez-les et dirigez-les vers une coloration appropriée telle que von Kossa et ALP mentionnées ci-dessus. Alternativement, si les poissons expérimentaux ont une étiquette fluorescente, placez la plaque dans un système d’imagerie en direct.REMARQUE : Si vous utilisez un système d’imagerie en direct, assurez-vous qu’il est réglé à une température et à un niveau de CO2 appropriés pour l’expérience. En règle générale, dans cette étude, 28 °C et 5 % de CO2 ont été utilisés. Sélectionner des filtres et des points de temps d’imagerie appropriés (ici, un intervalle de 2 ou 4 h, qui est suffisant pour suivre la migration des ostéoblastes, a été utilisé) et des objectifs à faible grossissement (c’est-à-dire 4x) pour assurer une imagerie uniforme de l’ensemble des puits. En effet, les écailles ont tendance à se déplacer à l’intérieur des puits, en particulier lors des changements de milieu.