تجديد قشور الزرد في ثقافة المقاييس توتو وخارج الجسم الحي
Summary
يصف هذا البروتوكول حصاد وتصور قشور الزرد أثناء التجديد في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم ثقافة خارج الجسم الحي لهذه المقاييس لمدة تصل إلى 7 أيام بعد الحصاد.
Abstract
غالبا ما تكون أمراض الهيكل العظمي معقدة في مسبباتها وتؤثر على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم. بسبب شيخوخة السكان ، هناك حاجة إلى علاجات جديدة يمكن أن تخفف العبء على أنظمة الرعاية الصحية. نظرا لأن هذه الأمراض معقدة ، فمن الصعب والمكلف نمذجة الفيزيولوجيا المرضية للعظام بدقة في بيئة معملية. يتمثل التحدي الذي يواجه هذا المجال في إنشاء منصة فعالة من حيث التكلفة وذات صلة بيولوجية لنمذجة أمراض العظام التي يمكن استخدامها لاختبار المركبات العلاجية المحتملة. يجب أن تسمح هذه المنصة بشكل مثالي بالتصور الديناميكي لسلوكيات الخلايا لبانيات العظم التي تبني العظام والخلايا الآكلة للعظام التي تعمل في بيئة المصفوفة المعدنية. يتم استخدام أسماك الزرد بشكل متزايد كنماذج بسبب توفر الأدوات الوراثية ، بما في ذلك خطوط المراسل المعدلة وراثيا ، وحقيقة أن بعض الأنسجة الهيكلية (بما في ذلك القشور) تظل شفافة حتى مرحلة البلوغ ، مما يسمح بخيارات التصوير الديناميكية. نظرا لأن قشور الزرد تحتوي على بانيات عظمية وناقضات عظمية وفيرة للغاية ، فإنها توفر موردا يسهل الوصول إليه ومتاحا بكثرة لوحدات العظام المستقلة. علاوة على ذلك ، بمجرد إزالتها ، تتجدد قشور الزرد البالغة بالكامل ، مما يوفر طريقة لدراسة النمو الزماني المكاني للأنسجة المعدنية في الجسم الحي. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكولات الحصاد وتتبع تجديد المقاييس. أخيرا ، يتم أيضا تقديم بروتوكول للاستزراع المستقر للحراشف خارج الجسم الحي لمدة أسبوع وبعد استجابة الشفاء بعد التلف المتحكم فيه للمصفوفة المعدنية للمقياس بمرور الوقت.
Introduction
العظام هي نسيج ضام صلب يشكل جزءا رئيسيا من الهيكل العظمي ، مما يتيح الحركة ويعمل كاحتياطي معدني في الجسم. من أجل الحفاظ على صحة العظام ، يعد التوازن الرائع بين تكوين العظام وتدهورها أمرا ضروريا من خلال النشاط المزدوج لبانيات العظم (التي هي الابتنائية) والخلايا الآكلة للعظم (التي تمتص العظام). يتعطل هذا التوازن بسبب الشيخوخة أو عدم التوازن الهرموني ، مما يؤدي غالبا إلى أمراض هشاشة العظام مثل هشاشة العظام1. على الرغم من الموافقة على الأدوية الموجودة لاستهداف أمراض هشاشة العظام ، إلا أن العديد منها له آثار جانبية. لذلك ، هناك حاجة إلى علاجات جديدة1. وبالتالي ، لا تزال هناك حاجة إلى مصادر وفيرة من الأنسجة العظمية ذات الصلة بيولوجيا والتي يمكن استخدامها لاختبار المركبات العلاجية المحتملة.
تقليديا ، تم استخدام نماذج القوارض وأنظمة زراعة الخلايا لدراسة بيولوجيا العظام. ومع ذلك ، أصبحت أسماك الزرد بشكل متزايد نموذجا آخر للاختيار. على الرغم من أنه ليس نظاما للثدييات ، إلا أن الزرد يوفر مزايا معينة لأبحاث العظام على القوارض. وتشمل هذه خصوبتها وشفافية اليرقات. حتى في مرحلة البلوغ ، تظل بعض الأنسجة الهيكلية ، بما في ذلك المقاييس والزعانف ، شفافة ، مما يسمح بالتصوير عالي الدقة في الجسم الحي وزيادة توافر طفرات الهيكل العظمي 2,3. كل من زعانف وقشور الزرد قادرة على التجديد الكامل بعد الإزالة. تمت دراسة تجديد الهيكل العظمي وإصلاح الإصابات لزعانف الزرد على نطاق واسع 4,5 ، في حين أن قشور الزرد هي نموذج عظمي أحدث في الحقل ولكنها توفر مزايا للاستزراع خارج الجسم الحي 6.
القشور وفيرة للغاية ، مع ما لا يقل عن 300 مقياس على كل سمكة تعمل كغطاء واقي للأسماك. كل مقياس عبارة عن صفيحة معدنية صغيرة تتكون من بانيات عظمية مكونة للعظام وناقضات عظمية ممتصة للعظام لمصفوفة هيكلية غنية بالكولاجين7. تتطلب عملية التعظم لكل من قشور الزرد والعظام البشرية تمايز الخلايا الجذعية الوسيطة إلى بانيات عظمية لتشكيل المصفوفة المعدنية. توفر قشور الزرد ميزة كبيرة لأبحاث الهيكل العظمي بقدرتها التجديدية القوية التي يمكن استخدامها لدراسة تجديد العظام وإصلاحها. ومع ذلك ، على الرغم من وجود كل من بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم ، تفتقر قشور الزرد إلى الخلايا العظمية المهمة لإعادة تشكيل العظام البشرية والإحساس الميكانيكي. يعني الموقع السطحي للموازين أنه يمكن إزالتها بسهولة باستخدام زوج من الملقط. عند إزالة المقياس ، تحدث سلسلة من الأحداث ، ويبدأ تجديد المقياس 8,9. هناك العديد من خيارات التلوين والتصوير المتاحة لتصور نشاط بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم وتمعدن الحراشف، كما هو موضح في الشكل 1. بالإضافة إلى ذلك ، فإن توفر العديد من خطوط المراسل الفلورية المعدلة وراثيا ذات الصلة من الزرد يعني أنه يمكن للمرء تصور ديناميكيات الخلية أثناء التجديد7،10،11. تسمح هذه العملية للمرء باكتساب المزيد من الفهم لتكوين عظام دي نوفو من خلال مراقبة الأنماط المبكرة لتجديد القشور على جانب السمكة لدراسة التشكل والنشاط الخلوي والملامح الجينية لهذه المقاييس المجددة. تم تمييز بيولوجيا تكوين المقياس وتجديده بشكل جيد. الأهم من ذلك ، يمكن أن تظهر المقاييس قدرة تنبؤية جيدة للمركبات ذات الصلة علاجيا12 ويؤدي علاج الأسماك بالجلوكوكورتيكويد إلى مقياس يتجدد لإظهار الأنماط الظاهرية لهشاشة العظام13. يظهر نسخ المقاييس المتجددة أن الجينات التي يتم تنشيطها في تجديد النطاق يتم إثراؤها لتلك المرتبطة بأمراض الهيكل العظمي البشري ، مما يدل على أهميتها كنظام نموذجي 6,14.
أخيرا ، يمكن استزراع هذه المقاييس خارج الجسم الحي لمدة تصل إلى 7 أيام. بالمقارنة مع مزارع خط الخلية التي تتكون عادة من نوع خلية واحدة ، توفر ثقافة خارج الجسم الحي فرصا لدراسة العظام في المختبر داخل بيئتها الطبيعية التي تحتوي على كل من بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم مع مصفوفتها الطبيعية خارج الخلية8،12،15،16.
تسمح لنا ثقافة المقياس أيضا بإجراء فحص المخدرات لأهداف ابتنائية عظمية جديدة. تعني وفرة القشور على الأسماك أنه يمكن للمرء أن يملأ لوحين على الأقل من الصفيحة المكونة من 96 بئرا من سمكة واحدة فقط ، مما يسمح بالغربلة المركبة في شكل متعدد الآبار حيث يحتوي كل بئر على مقياس واحد جنبا إلى جنب مع مكانته الطبيعية للخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن المقاييس رقيقة ، يمكن التنبؤ بامتصاص الدواء12. باختصار ، تتمتع قشور الزرد elasmoid بإمكانات كبيرة في أبحاث الهيكل العظمي ويمكن أن تساعدنا في اكتساب المزيد من التبصر في الأحداث الخلوية أثناء تكوين العظام وإصلاحها. هنا ، نصف بروتوكولات حصاد المقاييس لمتابعة التجديد في الجسم الحي وزراعة المقاييس خارج الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحمل قشور الزرد elasmoid ، كنموذج جديد لأبحاث الهيكل العظمي ، إمكانات كبيرة للمساعدة في فهمنا لصيانة العظام وتجديدها وإصلاح الإصابات. تسمح وفرة القشور على الأسماك بفحص مركب متوسط إلى عالي الإنتاجية مع تقليل عدد المستخدمة والحد من التباين داخل الفرد. هنا ، يتم تقديم بروتوكولات لتجديد النطاق وثقافة النطاق خارج الجسم الحي لدراسة التجديد والإصلاح.
يجب مراعاة بعض الخطوات الحاسمة عند اتباع هذا البروتوكول. تعد الإزالة الدقيقة للقشور أمرا ضروريا ، خاصة عند استخدام خط مراسل معدل وراثيا للحد من الاضطراب في عدد الخلايا الناجم عن الحصاد. إذا كان لا بد من إجراء مقارنات مع المقاييس الجينية ، فتأكد من أن المنطقة لا تحتوي على قشور متجددة تلقائيا (والتي يمكن أن تحدث بشكل طبيعي خلال عمر الأسماك). تأكد من أن البيئة والمعدات معقمة للزراعة خارج الجسم الحي لتحقيق بقاء الخلية الأمثل والحد الأدنى من العدوى في الثقافة.
اعتمادا على سؤال البحث المحدد ، يمكن إجراء تعديلات على البروتوكول ، مثل الجمع بين خطوط مراسل معدلة وراثيا مختلفة لتصور أنواع الخلايا الأخرى من ملفات تعريف التعبير الجيني أثناء التجديد والإصلاح11,14.
إن النطاق الواسع للتلطيخ الذي يمكن للمرء أن يؤديه على المقاييس يعني أنه لكل مركب أو حالة تم اختبارها يمكن للمرء أن ينظر إلى آثاره على العظام من زوايا مختلفة. بينما يمكن لمراسلي SP7 / OSX إظهار أرقام بانيات العظم ، يمكن أن يتصور تلطيخ ALP نشاط بانيات العظم ، ويمكن أن يتصور تلطيخ TRAP نشاط ناقضة العظم ، ويمكن أن يؤدي تلطيخ Calcein الأخضر الحي إلى تسمية العظام المشكلة حديثا ويمكن أن يظهر تلطيخ Alizarin الأحمر أو von Kossa تمعدن الحجم. يمكن أيضا استخدام نشاط Luciferase لتحديد بانيات العظم12. جنبا إلى جنب مع تقنيات التلوين هذه ، يمكن للمرء أن يتعلم المساهمة النسبية لبانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم في تأثير عظمي معين. تفتقر المقاييس إلى الخلايا العظمية ، المنتشرة في عظام الثدييات وهي الدوافع الرئيسية للاستجابة الحسية الميكانيكية للعظام. يتم إصلاح المقياس وتجديده في هذا النموذج بشكل أساسي بواسطة بانيات العظم مع إعادة التشكيل اللاحقة بواسطة ناقضات العظم 8,9. من الأهمية بمكان ملاحظة أن الاختلاف يحدث بين الأفراد والفئات العمرية20. لتقليل ذلك ، يجب أن تكون مساحة الحصاد على نطاق واسع ثابتة ، حيث يمكن أن تؤدي المواقع المختلفة إلى ظهور أشكال مختلفة على نطاق واسع ، ويتم استخدام الأسماك من نفس مجموعات الأشقاء بحيث يكون العمر والحجم متسقين. ومع ذلك ، نظرا لأنه يمكن حصاد مقاييس متعددة لكل سمكة ، يمكن للمرء إجراء المزيد من التجارب باستخدام عدد أقل من الأسماك ، مما يقلل من التباين داخل الفرد.
باختصار ، تظهر هذه البروتوكولات تقنيات تجريبية يمكن تطبيقها على المقاييس الجينية والتجديدية. في الختام ، تظهر قشور elasmoid إمكانات كبيرة كنموذج هيكلي للمساعدة في فهم تكوين العظام وإصلاحها. وسوف يساعد على الحد من استخدام لفحص مركب العظم عالي الإنتاجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ماثيو جرين من وحدة خدمة لتربية الأسماك وكاتي جيبسون من مركز وولفسون للتصوير الحيوي. تم تمويل CLH و DB و QT من قبل Versus Arthritis (زمالة CLH العليا 21937 ، DB و QT Intermediate Fellowship 22044) ، تم تمويل RR من قبل (NHMRC APP1158758). تم دعم هذا العمل أيضا من خلال منحة BBSRC (BB / T001984 / 1).
Materials
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
| 12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
| 15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
| Alizarin red | Sigma | A5533 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
| Calcein powder | Sigma | C0875 | |
| Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
| Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Cover slips | VWR | 631-0146 | |
| Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
| Danieau | Sigma | ||
| DMEM | Life Technologies | 31053 | |
| Falcon tubes | Corning | 430828 | |
| Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
| Glycerol | Sigma | 81381 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
| IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
| Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
| L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
| Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
| Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| MQ water | X | ||
| N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
| NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
| NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
| Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
| Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
| Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
| Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
| Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
| Tris | Sigma | 252859 | |
| Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
| Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
| Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L – 28 cm x 11 cm x 17 cm |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L – 28 cm x 7 cm x 11 cm |
References
- Tobias, J. H., et al. Opportunities and challenges in functional genomics research in osteoporosis: report from a workshop held by the causes working group of the osteoporosis and bone research academy of the Royal Osteoporosis Society on October 5th 2020,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2021).
- Busse, B., Galloway, J. L., Gray, R. S., Harris, M. P., Kwon, R. Y. Zebrafish: An emerging model for orthopedic research. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 925-936 (2020).
- Dietrich, K., et al. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 436-458 (2021).
- McGowan, L. M., Kague, E., Vorster, A., Newham, E., Cross, S., Hammond, C. L. Wnt16 elicits a protective effect against fractures and supports bone repair in zebrafish. JBMR Plus. 5 (3), 10461 (2021).
- Sehring, I., Weidinger, G. Zebrafish fin: Complex molecular interactions and cellular mechanisms guiding regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (7), 040758 (2022).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10 (6), (2019).
- Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, 37001 (2018).
- Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Developmental Biology. 437 (2), 105-119 (2018).
- Metz, J. R., de Vrieze, E., Lock, E. J., Schulten, I. E., Flik, G. Elasmoid scales of fishes as model in biomedical bone research. Journal of Applied Ichthyology. 28 (3), 382-387 (2012).
- Cox, B. D., De Simone, A., Tornini, V. A., Singh, S. P., Di Talia, S., Poss, K. D. In toto imaging of dynamic osteoblast behaviors in regenerating skeletal bone. Current Biology. 28 (24), 3937-3947 (2018).
- Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2020).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex-vivo sp7: Luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
- De Vrieze, E., Moren, M., Metz, J. R., Flik, G., Lie, K. K. Arachidonic acid enhances turnover of the dermal skeleton: Studies on zebrafish scales. PLoS One. 9 (2), 89347 (2014).
- Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biology. 20 (1), 21 (2022).
- Bergen, D. J. M., et al. High bone mass disorders: New insights from connecting the clinic and the bench. Journal of Bone and Mineral Research. , (2022).
- Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell and Tissue Research. 350 (1), 69-75 (2012).
- Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Developmental Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
- Ethiraj, L. P., Fong, E. L. S., Liu, R., Chan, M., Winkler, C., Carney, T. J. Colorimetric and fluorescent TRAP assays for visualising and quantifying fish osteoclast activity. European Journal of Histochemistry. 66 (2), 3369 (2022).
- DeLaurier, A., et al. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505 (2010).
- Carnovali, M., Banfi, G., Mariotti, M. Age-dependent modulation of bone metabolism in zebrafish scales as new model of male osteoporosis in lower vertebrates. Geroscience. 43 (2), 927-940 (2021).
