Este protocolo describe la recolección y visualización de las escamas elasmoides del pez cebra durante la regeneración in vivo . Además, se presenta el cultivo ex vivo de estas escamas hasta 7 días después de la cosecha.
Las enfermedades esqueléticas suelen ser complejas en su etiología y afectan a millones de personas en todo el mundo. Debido al envejecimiento de la población, existe la necesidad de nuevas terapias que puedan aliviar la carga de los sistemas sanitarios. Como estas enfermedades son complejas, es difícil y costoso modelar con precisión la fisiopatología ósea en un entorno de laboratorio. El desafío para el campo es establecer una plataforma rentable y biológicamente relevante para modelar la enfermedad ósea que pueda usarse para probar posibles compuestos terapéuticos. Idealmente, una plataforma de este tipo debería permitir la visualización dinámica de los comportamientos celulares de los osteoblastos formadores de hueso y los osteoclastos degradadores de hueso que actúan en su entorno de matriz mineralizada. El pez cebra se utiliza cada vez más como modelo debido a la disponibilidad de herramientas genéticas, incluidas las líneas reporteras transgénicas, y al hecho de que algunos tejidos esqueléticos (incluidas las escamas) permanecen translúcidos hasta la edad adulta, lo que permite opciones de imágenes dinámicas. Dado que las escamas del pez cebra tienen osteoblastos y osteoclastos y son muy abundantes, proporcionan un recurso fácilmente accesible y abundantemente disponible de unidades óseas independientes. Además, una vez retiradas, las escamas adultas del pez cebra se regeneran por completo, lo que ofrece una forma de estudiar el crecimiento espacio-temporal del tejido mineralizado in vivo. A continuación, detallamos los protocolos de recolección y seguimiento de la regeneración de las escamas. Por último, también se presenta un protocolo para el cultivo estable de escamas ex vivo durante una semana y después de la respuesta de cicatrización después de un daño controlado a la matriz mineralizada de la escama a lo largo del tiempo.
El hueso es un tejido conectivo duro que forma una parte importante del esqueleto, lo que permite la locomoción y actúa como una reserva mineral en el cuerpo. Para mantener un hueso sano, es esencial un equilibrio exquisito entre la formación y la degradación ósea a través de la actividad acoplada de los osteoblastos (que son anabólicos) y los osteoclastos (que reabsorben el hueso). Este equilibrio se ve alterado por el envejecimiento o el desequilibrio hormonal, lo que a menudo conduce a enfermedades de fragilidad ósea como la osteoporosis1. Aunque los medicamentos existentes han sido aprobados para tratar las enfermedades de fragilidad ósea, muchos tienen efectos secundarios; Por lo tanto, existe la necesidad de nuevas terapias1. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con abundantes fuentes de tejido óseo biológicamente relevante que puedan utilizarse para probar posibles compuestos terapéuticos.
Tradicionalmente, los modelos de roedores y los sistemas de cultivo celular se han utilizado para estudiar la biología ósea. Sin embargo, el pez cebra se está convirtiendo cada vez más en otro modelo de elección. Si bien no es un sistema de mamíferos, el pez cebra ofrece ciertas ventajas para la investigación de huesos sobre los roedores; entre ellos se encuentran su fecundidad y la translucidez de las larvas; Incluso en la edad adulta, algunos tejidos esqueléticos, incluyendo las escamas y las aletas, permanecen translúcidos, lo que permite la obtención de imágenes in vivo de alta resolución y la mayor disponibilidad de mutantes esqueléticos 2,3. Tanto las aletas como las escamas del pez cebra son capaces de regenerarse por completo después de su eliminación. La regeneración esquelética y la reparación de lesiones de las aletas del pez cebra se han estudiado ampliamente 4,5, mientras que las escamas del pez cebra son un modelo óseo más nuevo en el campo, pero ofrecen ventajas para el cultivo ex vivo 6.
Las escamas son muy abundantes, con al menos 300 escamas en cada pez que sirven como cubierta protectora para los peces. Cada escama es una pequeña placa mineralizada que consiste en osteoblastos formadores de hueso y osteoclastos de reabsorción ósea de una matriz esquelética rica en colágeno7. El proceso de osificación tanto de las escamas de pez cebra como de los huesos humanos requiere la diferenciación de las células madre mesenquimales en osteoblastos para formar la matriz mineralizada. Las escamas de pez cebra ofrecen una gran ventaja para la investigación esquelética con su fuerte capacidad regenerativa que se puede utilizar para estudiar la regeneración y reparación ósea. Sin embargo, a pesar de la presencia tanto de osteoblastos como de osteoclastos, las escamas del pez cebra carecen de osteocitos que son importantes para la remodelación ósea humana y la mecanosensación; La ubicación superficial de las escamas significa que se pueden quitar fácilmente con un par de fórceps. Tras la eliminación de la incrustación, se produce una cascada de eventos y comienza la regeneración de la incrustación 8,9. Hay varias opciones de tinción e imágenes disponibles para visualizar la actividad de los osteoblastos y osteoclastos y la mineralización de las escamas, como se muestra en la Figura 1. Además, la disponibilidad de muchas líneas reporteras transgénicas fluorescentes relevantes del pez cebra significa que se puede visualizar la dinámica celular durante la regeneración 7,10,11. Este proceso permite obtener una mayor comprensión de la formación ósea de novo mediante la observación del patrón temprano de regeneración de escamas en el flanco de los peces para estudiar la morfología, la actividad celular y los perfiles genéticos de estas escamas regeneradas. La biología de la formación y regeneración de escamas ha sido bien caracterizada. Es importante destacar que las escamas pueden mostrar una buena capacidad predictiva de compuestos terapéuticamente relevantes12 y el tratamiento de peces con glucocorticoides conduce a una escama que se regenera para mostrar fenotipos osteoporóticos13. El transcriptoma de las escamas regeneradoras muestra que los genes activados en la regeneración de escamas están enriquecidos para aquellos vinculados a enfermedades esqueléticas humanas, lo que demuestra aún más su relevancia como sistema modelo 6,14.
Finalmente, estas escamas se pueden cultivar ex vivo durante un máximo de 7 días. En comparación con los cultivos de líneas celulares que normalmente están compuestos por un solo tipo de célula, el cultivo a escala ex vivo ofrece oportunidades de estudio óseo in vitro dentro de su entorno natural que contiene osteoblastos y osteoclastos con su matriz extracelular natural 8,12,15,16.
El cultivo a escala también nos permite realizar el cribado de fármacos para nuevas dianas osteoanabólicas. La abundancia de escamas en los peces significa que se pueden llenar al menos dos placas de la placa de 96 pocillos de un solo pez, lo que permite el cribado compuesto en un formato de pocillos múltiples en el que cada pocillo contiene una escama junto con su nicho natural de células. Además, dado que las escamas son delgadas, la absorción del fármaco es predecible12. En resumen, las escamas elasmoides del pez cebra tienen un gran potencial en la investigación esquelética y pueden ayudarnos a obtener más información sobre los eventos celulares durante la formación y reparación ósea. Aquí, describimos los protocolos para la cosecha de escamas para seguir la regeneración in vivo y cultivar las escamas ex vivo.
Las escamas elasmoides del pez cebra, como modelo novedoso para la investigación esquelética, tienen un gran potencial para ayudar a nuestra comprensión del mantenimiento óseo, la regeneración y la reparación de lesiones. La abundancia de escamas en los peces permite un cribado de compuestos de rendimiento medio a alto, al tiempo que reduce el número de animales utilizados y limita la variación intraindividual. Aquí, se presentan protocolos para la regeneración de escamas y el cultivo de escamas ex vivo para estudiar la regeneración y reparación.
Es necesario tener en cuenta algunos pasos críticos a la hora de seguir este protocolo. La eliminación cuidadosa de las escamas es esencial, especialmente cuando se utiliza una línea reportera transgénica para limitar la perturbación de la población celular causada por la recolección. Si se van a hacer comparaciones con las escamas ontogenéticas, asegúrese de que la región no contenga escamas que se regeneran espontáneamente (lo que puede ocurrir naturalmente a lo largo de la vida útil de los peces). Asegúrese de que el entorno y el equipo sean estériles para el cultivo ex vivo a fin de lograr una supervivencia celular óptima y una infección mínima en el cultivo.
Dependiendo de la pregunta de investigación específica, se pueden realizar adaptaciones al protocolo, como la combinación de diferentes líneas reporteras transgénicas para visualizar otros tipos celulares de perfiles de expresión génica durante la regeneración y reparación11,14.
El amplio rango de tinción que se puede realizar en las básculas significa que para cada compuesto o condición probada se pueden observar sus efectos en el hueso desde diferentes ángulos; mientras que los reporteros sp7/osx pueden mostrar el número de osteoblastos, la tinción de ALP puede visualizar la actividad de los osteoblastos, la tinción de TRAP puede visualizar la actividad de los osteoclastos, la tinción viva de verde de calceína puede etiquetar el hueso recién formado y la tinción de rojo de alizarina o von Kossa puede mostrar mineralización de escamas. También se puede utilizar la actividad de la luciferasa para cuantificar los osteoblastos12. En combinación con estas técnicas de tinción, se puede conocer la contribución relativa de los osteoblastos y osteoclastos a un efecto óseo determinado. Las escamas carecen de osteocitos, que son prevalentes en el hueso de mamíferos y son los principales impulsores de la respuesta mecanosensorial ósea; La reparación y regeneración de las incrustaciones en este modelo son impulsadas principalmente por los osteoblastos con la posterior remodelación por osteoclastos 8,9. Es crucial tener en cuenta que la variación ocurre entre individuos y grupos de edad20. Para minimizar esto, el área de cosecha de escamas debe ser constante, ya que diferentes ubicaciones pueden dar lugar a diferentes morfologías de escamas, y se utilizan peces de los mismos grupos hermanos para que la edad y el tamaño sean consistentes. Sin embargo, debido a que se pueden cosechar múltiples escamas por pez, se pueden realizar más experimentos con menos peces, lo que reduce la variabilidad intraindividual.
En resumen, estos protocolos muestran técnicas experimentales que pueden aplicarse a escalas ontogenéticas y de regeneración. En conclusión, las escamas elasmoides muestran un gran potencial como modelo esquelético para ayudar a la comprensión de la formación y reparación ósea; y ayudará a reducir el uso de animales para el cribado de compuestos osteoanabólicos de alto rendimiento.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Mathew Green de la Unidad de Servicio Animal para la cría de peces y a Katy Jepson del Centro de Bioimágenes Wolfson. CLH, DB y QT fueron financiados por Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB and QT Intermediate Fellowship 22044), RR fue financiado por (NHMRC APP1158758). Esta labor también contó con el apoyo de la subvención del BBSRC (BB/T001984/1).
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
Alizarin red | Sigma | A5533 | |
Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
Calcein powder | Sigma | C0875 | |
Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
Cover slips | VWR | 631-0146 | |
Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
Danieau | Sigma | ||
DMEM | Life Technologies | 31053 | |
Falcon tubes | Corning | 430828 | |
Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
Glycerol | Sigma | 81381 | |
Hepes | Sigma | H3375 | |
Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
MQ water | X | ||
N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
Tris | Sigma | 252859 | |
Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L – 28 cm x 11 cm x 17 cm |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L – 28 cm x 7 cm x 11 cm |