Zebravis Scale Regeneratie In Toto en Ex Vivo Kweek van Schubben

De University Animal Scientific Unit (ASU) is verantwoordelijk voor de verzorging van zebravissen onder begeleiding van de richtlijnen voor het houden van zebravissen. Alle procedures, waaronder het oogsten van kalkaanslag, het kleuren van levende botten en live beeldvorming, zijn goedgekeurd en uitgevoerd onder een UK Home Office Project License (PP4700996). Voor dit manuscript is gebruik gemaakt van jongvolwassen transgene zebravissen uit de sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46] lijn17. De vissen omvatten zowel mannetjes als vrouwtjes van 4 maanden oud. 1. Regeneratie op in-vivoschaal Voordat u met het schaalregeneratie-experiment begint, brengt u zebravissen over van hun hoofdtanks naar individuele tanks (zie Tabel met materialen) en keert u terug naar deze individuele tanks na beeldvorming tijdens het experiment, zoals weergegeven in figuur 2. Dit is om ervoor te zorgen dat alle regenererende schubben de schubben zijn die voor het experiment zijn geoogst; Groepshuisvesting kan leiden tot sporadisch verlies van schubben als gevolg van verwondingen veroorzaakt door andere vissen.OPMERKING: De vissen worden individueel geplaatst om gevechten en daaropvolgend schaalverlies tussen vissen te voorkomen. Noteer informatie voor elke experimentvis (d.w.z. genotype, leeftijd en geslacht) volgens het ontwerp van het experiment. Gebruik een camera (smartphonecamera’s werken prima) om een foto te maken van elke vis naast een liniaal om de grootte/lengte en gezondheidstoestand van de vis vast te leggen. Verdoof de zebravis op de dag van het experiment met 0,05% (v/v) tricaïne methaansulfonaat (MS222, zie Materiaaltabel) door onderdompeling, en plaats deze vervolgens op een petrischaal met een vochtig weefsel om beweging van de vis tijdens beeldvorming of oogsten te voorkomen. Leg de vis op zijn kant (meestal wordt hier de linkerflank gebruikt voor consistentie). Voer flankbeeldvorming uit met behulp van een stereomicroscoop met de juiste vergroting (meestal werden 2x, 4x en/of 6,3x en 8x gebruikt voor het huidige onderzoek om zowel het algehele regeneratiegebied als het ingezoomde gebied vast te leggen voor gedetailleerde observatie).OPMERKING: De tijdstippen voor flankbeeldvorming zijn afhankelijk van het experimentele doel en de keuze van transgene verslaggevers. Om bijvoorbeeld osteoblasten te volgen tijdens de regeneratie van kalkaanslag, zijn de voorgestelde tijdstippen dag 0 (ontogetisch), 2 dagen na de oogst (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Om de effecten van herhaalde anesthesie te verminderen, moet u de beeldvormingstijdstippen zo min mogelijk houden die nodig zijn voor het experiment. Oogst schubben met een fijn pincet en een pincet onder de stereomicroscoop. Breng de geoogste schubben over in opvangbuizen om ze later te kleuren.OPMERKING: Het maximale aantal schubben dat kan worden geoogst, hangt af van de lokale ethische goedkeuringen die van kracht zijn. We oogsten meestal ongeveer 20 tot 30 schubben en verzamelen ze in individuele opvangbuizen om later kalkvlekken te maken, zoals ALP, von Kossa14. Vang de weegschaal op in een opvangbuisje van 1.5 ml of 2 ml. Dit is afhankelijk van de gebruikte kleurtechniek.Breng voor zowel ALP- als von Kossa-kleuring de schubben over in verzamelbuizen met gedeïoniseerd water, terwijl voor TRAP-kleuring of immunohistochemie de schubben overbrengen in verzamelbuizen die 4% PFA (fixeeroplossing) bevatten. Optioneel: Voordat u weegschalen in buizen overbrengt, moet u indien nodig beelden maken van individuele geoogste weegschalen.OPMERKING: Voorgestelde tijdstippen voor het oogsten van weegschalen zijn dag 0 (ontogetisch), dag 10 en dag 21 (geregenereerde schubben). 2. Kleuring van levende botten OPMERKING: Levende skeletkleuring kan worden uitgevoerd wanneer experimentele vissen niet transgeen zijn voor fluorescerende reporters of wanneer ze eenkleurige transgene reporters bij zich hebben. Levende kleuring kan worden gebruikt als aanvulling op transgenen; men kan bijvoorbeeld een osteoblastreporter zoals sp7/osx in één kleur (bijv. GFP) gebruiken en vervolgens bot in rood kleuren met Alizarinerood (AR). AR en calcein green kunnen samen voor dezelfde vis worden gebruikt; in dit scenario wordt AR gebruikt om origineel of ontogenetisch bot te labelen door zich te binden aan de gemineraliseerde matrix van verouderd bot, en calceïne bindt zich aan calciumionen die overvloedig aanwezig zijn in nieuw gevormd bot. Bij het kleuren van een ontogenetische schaal kan AR bijvoorbeeld worden gevisualiseerd, maar calceïnegroen kan afwezig of minimaal zijn, omdat ontogenetische schalen lage niveaus van nieuwe botvorming hebben. Voer live Alizarin Red (AR)-kleuring uit.Bereid een fles met 2x AR-kleuringsoplossing door 0,5% (w/v) voorraad Alizarine-oplossing (10 ml) te mengen met 10 ml 1 M voorraad HEPES (eindconcentratie, 10 mM) (zie materiaaltabel). Vul tot 1 L aan met 1x Danieau oplossing (zie Materiaaltabel). De oplossing moet in het donker worden bewaard of in folie worden omwikkeld. Breng op de dag van het experiment 500 ml 2x AR-oplossing naar de zebravisfaciliteit en voeg 500 ml systeemwater (uit het aquarium) toe om 1x werkende AR-oplossing te maken. Breng de vissen uit hun aquarium over in een 1x werkende AR-kleuringsoplossing en laat ze 15-20 minuten staan. Was de overtollige vlek op de vis af met 15 minuten ‘wassen’ in het systeemwater. Voer live Calcein Green-kleuring uit.Bereid een fles met 2x Calcein Green kleuringsoplossing door 45 mg Calceïnepoeder toe te voegen aan 900 ml 1x Danieau-oplossing (zie Materiaaltabel). Gebruik een magnetische roerder om het poeder volledig te laten oplossen. Stel de pH in op 8. Dit is de 2x voorraad Calcein Green oplossing. De oplossing kan maximaal 1 maand in het donker worden bewaard/in folie worden omwikkeld. Breng op de dag van het experiment 500 ml 2x Calcein Green-oplossing naar de zebravisfaciliteit en voeg 500 ml systeemwater toe om 1x werkende Calcein Green-oplossing te maken. Het wordt aanbevolen om vers gemaakte Calcein-kleuroplossing te gebruiken. Breng de vissen uit hun aquarium over in 1x werkende Calcein Green-kleuroplossing en laat ze 1-2 uur staan. Afhankelijk van de grootte van de vis kan een langere kleurtijd nodig zijn. Was de overtollige vlek op de vis af door 15 minuten te ‘wassen’ in het systeemwater.OPMERKING: Afbeelding de Calcein Green bevlekte vis zo snel mogelijk, aangezien deze vlek binnen een paar uur zal vervagen. 3. Alkalische fosfatase (ALP) kleuring op schubben na de oogst Bereid de ALP-kleuroplossing door 100 mM Tris (pH 9,5 met HCl) te mengen met 100 mM NaCl en 50 mM MgCl2. Gebruik in de handel verkrijgbare NBT/BCIP-voorraadoplossing (zie Materiaaltabel). Breng de schubben over in buizen met gedeïoniseerd water. Spoel de schubben 5 minuten af in ALP-kleurstofoplossing. Bereid ondertussen een werkende kleuroplossing door 200 μL van de NBT/BCIP-oplossing toe te voegen aan 10 ml ALP-kleuringsbuffer. Dit moet vers worden bereid op het moment van kleuren. Kleur de schubben gedurende 15 minuten met de werkende ALP-kleurstofoplossing. Stop de reactie door de weegschaal te spoelen met gedeïoniseerd water. 4. Von KOSSA-kleuring op schubben na de oogst Bereid 5% (m/v) zilvernitraatoplossing. Bereid 5% (m/v) natriumthiosulfaatoplossing. Breng de geoogste schubben over in buizen met gedeïoniseerd water. Incubeer de schubben gedurende 40 minuten in de zilvernitraatoplossing onder sterk licht.NOTITIE: Draag PBM’s (persoonlijke beschermingsmiddelen) omdat zilvernitraat een vlek achterlaat die moeilijk te verwijderen is. Was de weegschaal twee keer gedurende 5 minuten met gedeïoniseerd water.OPMERKING: Zilvernitraatafval moet worden ingezameld en afgevoerd volgens de lokale richtlijnen. Incubeer de schubben gedurende 5 minuten in natriumthiosulfaat. Was de weegschaal twee keer gedurende 5 minuten met gedeïoniseerd water. 5. Colorimetrische TRAP-kleuring OPMERKING: Voor de gedetailleerde procedure verwijzen wij u naar eerder gepubliceerd werk18. Bereid de kleuroplossingen voor.Bereid 10 mg/ml naftol-AS-MX-fosfaatoplossing.Weeg 5 mg naftolfosfaat AS-MX-fosfaat af (zie materiaaltabel). Maak in de zuurkast een buisje met 0,5 ml N’-dimethylformamide en los 5 mg Naftol-AS-MX-fosfaat op in 0,5 ml N’-dimethylformamide om een stockoplossing van 10 mg/ml Naftol-AS-MX-fosfaat te maken (voorzichtig schudden). Bereid 1,6 mM Fast Red Violet LB-bouillonoplossing in 50 mM natriumtartraat.Bereid 50 ml 0,1 M natriumacetaat bij pH 5 (voeg 0,41015 g natriumacetaat toe aan 50 ml gedeïoniseerd water en pas de pH aan op 5 met 100% azijnzuur). Los 0,575 g dibasisch natrium-L-tartraat (zie materiaaltabel) op in 50 ml 0,1 M natriumacetaatbuffer (pH = 5). Voeg 30 mg snel rood violet LB-zout toe. Bereid PBS-0.1Tx (los 500 μL Triton-X op in 500 ml PBS).Bereid PBS-0.1Tw (los 500 μL Tween-20 op in 500 ml PBS). Bereid een werkende TRAP-oplossing voor.Meng beide stockoplossingen samen in de zuurkast (0,5 ml 10 mg/ml naftol-AS-MX-fosfaatoplossing en 50 ml 1,6 mM Fast Red Violet LB-bouillonoplossing in 50 mM natriumtartraat).NOTITIE: De werkoplossing kan nu buiten de zuurkast worden gebruikt. Het kan maximaal een maand in de koelkast worden bewaard (verpakt in folie). Bewaar in aparte containers van antilichamen of andere reagentia die gevoelig zijn voor fixeermiddelen. Blijf zoveel mogelijk uit de buurt van licht. Optioneel: bereid bleekoplossing (op post-gefixeerde monsters die TRAP-gekleurd waren) in PBS en 0,1% Tween-20 (PBS-0,1%Tw). Maak een mengsel van 0,5% kaliumhydroxide (KOH) (van 10% stockoplossing (m/v)) en 3% waterstofperoxide (H2O2) (33% stockoplossing, bewaard in de koelkast). Voer monsterfixatie uit.Bevestig de weegschaal in 4% PFA in 1x PBS schommelen of draaien gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder de 4% PFA en was met PBS-0.1Tx minstens 3 keer gedurende 5 minuten per wasbeurt. Ga direct over op TRAP-kleuring (de beste aanpak) of bewaar het een nacht in PBS-0.1 Tx. Voer TRAP-kleuring van de schubben uit.Verwijder de PBS-0.1 Tx-oplossing en voeg de colorimetrische TRAP-werkoplossing toe (stap 5.2.1) om de monsters volledig te bedekken (d.w.z. 1 ml in een microcentrifugebuis van 1.5 ml). Incubeer 1-2 uur bij RT, schommelend in het donker. Verwijder de kleuroplossing en was minstens 3 keer met PBS-0.1 Tw gedurende 5 minuten per wasbeurt. Fixeer de monsters in 4% PFA gedurende 30 minuten bij RT, zachtjes schommelend in het donker. Verwijder de PFA-oplossing door 3 keer te wassen met PBS-0.1 Tw gedurende 5 minuten per stap.OPMERKING: De monsters kunnen voor onbepaalde tijd worden bewaard (in bewaaroplossingen/gemonteerd op microscoopglaasjes) bij 4 °C in het donker. 6. Montage van bevlekte schubben Bereid het montagemedium voor door 2,4 g Mowiol 4-88 kristallen toe te voegen aan 6 g glycerol (zie Materiaaltabel). Alle gewenste montagemedia kunnen worden gebruikt. Voeg 6 ml gedeïoniseerd water toe en laat een uur op een magneetroerder staan. Voeg 12 ml 0,2 M Tris (pH 8,5) toe en incubeer bij ongeveer 53 ° C totdat de Mowiol-kristallen volledig zijn opgelost. Klameer de oplossing door 20 minuten bij kamertemperatuur te centrifugeren bij 2000 x g . Breng de oplossing over in een opslagcontainer. Het montagemedium is ongeveer 12 maanden houdbaar in de vriezer. De ontdooide Mowiol-oplossing is tot 1 maand stabiel. Monteer de weegschaal op een microscoopglaasje in de montage van het medium, bedek ze met een dekglaasje en bekijk ze onder een microscoop. 7. Ex vivo cultuur van weegschalen OPMERKING: Deze stap is overgenomen van de Vrieze et al.12. Voordat u de schubben in een steriele omgeving oogst, bereidt u het osteogene medium en de kweekplaat voor.Osteogeen kweekmedium (OCM): Maak in een steriele centrifugebuis 15 ml OCM in standaard celkweekmedium (hoge glucose, geen glutamine, geen fenolrood) in de uiteindelijke concentraties van 1% runderkalverserum, 1% (200 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide in 0,85% NaCl), 1% antibiotische/antimycotische oplossing (100x) oplossing, 4 mM CaCl2, 10 mM β-glycerofosfaat, 1 nM natriumpyruvaat en 1% amfotericine B (optioneel) (zie materiaaltabel). Giet de OCM in een steriel reagensreservoir en voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL toe aan elk putje van de plaat met 96 putjes. Sluit de plaat met 96 putjes af en berg de plaat op. OCM kan voor een korte periode in de koelkast worden bewaard (‘s nachts tot 1 week) en voor gebruik op 28 °C worden bewaard. Voer kalkoogst en PBS-wassen uit.Oogst de schubben met een steriel pincet en deponeer ze in een petrischaaltje met een steriele PBS-oplossing. Voer de plaatinstelling uit.Breng elke schaal van de petrischaal over naar elk putje op de plaat met 96 putjes met 100 μL OCM (opgewarmd tot 28 °C) met behulp van een steriele pincet. Zodra alle schubben op de plaat zijn overgebracht, brengt u de plaat onder een stereomicroscoop. Gebruik een fijne, steriele pipetpunt om elke schub voorzichtig naar de bodem van het putje te verplaatsen en houd ze uit de buurt van de zijkant van de putjes om lichtreflectie tijdens beeldacquisitie te voorkomen.OPMERKING: Deze stap is alleen vereist als u live beeldvorming uitvoert. Breng de plaat voorzichtig over naar de incubator of het Live Imaging System (LIS, zie Materiaaltabel) (ingesteld op 28 °C, 5% CO2), waar de weegschaal maximaal 7 dagen kan worden gekweekt. OCM vernieuwen (optioneel).Verwarm de OCM die in de koelkast is bewaard tot 28 °C. Breng de plaat met 96 putjes voorzichtig over naar een steriele omgeving. Zuig met een meerkanaalspipet 50 μl uit elk putje op. Druk hiervoor de punten tegen de wanden en dompel ze niet tot aan de onderkant om te voorkomen dat de schubben worden opgezogen/verplaatst/verwijderd. Gebruik nieuwe tips voor verschillende omstandigheden. Giet de OCM in een steriel reagensreservoir en voeg met behulp van de meerkanaalspipet 60 μL OCM toe aan elk putje. Plaats de plaat onder de stereomicroscoop en controleer op verkeerd geplaatste schubben (te dicht bij de wanden, zwevend of in een verticale positie in de media). Verplaats ze indien nodig met een fijne, steriele pipetpunt. Plaats de plaat terug in de couveuse/LIS.OPMERKING: Ververs het medium niet als het experiment circadiaans ritme (CR) betreft, aangezien serumshock de biologische klok kan beïnvloeden. Let op: bij het bestuderen van CR merkt CR op dat lichtomstandigheden ook de klok resetten. Voer kleuring en beeldvorming na het kweken van schaal uit (optioneel).Na 6 dagen kweken, fixeer ze en richt ze op de juiste kleuring zoals von Kossa en ALP hierboven vermeld. Als alternatief, als de experimentele vissen een fluorescerend label hebben, plaatst u de plaat in een live beeldvormingssysteem.NOTITIE: Als u een live beeldvormingssysteem gebruikt, zorg er dan voor dat dit is ingesteld op een temperatuur en CO2 -niveau dat geschikt is voor het experiment. In dit onderzoek werd doorgaans 28 °C en 5% CO2 gebruikt. Selecteer geschikte filters en beeldvormingstijdstippen (hier werd een interval van 2 of 4 uur gebruikt, dat voldoende is om de migratie van osteoblasten te volgen) en doelstellingen met een lage vergroting (d.w.z. 4x) om een gelijkmatige beeldvorming van de hele put te garanderen. Dit komt omdat de schubben de neiging hebben om in de putten te bewegen, vooral tijdens mediawisselingen.