Сборка и эксплуатация ступени охлаждения для иммобилизации C. elegans на их культуральных пластинах

1. Изготовление и подготовка каждого компонента ступени охлаждения ПРИМЕЧАНИЕ: Ступень охлаждения состоит из нескольких компонентов (см. Таблицу материалов). Большинство комплектующих имеются в готовом виде. Сапфировое окно требует индивидуального заказа, в то время как медная пластина, удерживающий кронштейн и изолирующая пластина могут быть изготовлены на месте с помощью станка с числовым программным управлением или 3D-принтера. После первоначального изготовления последующий процесс сборки занимает около 2-3 часов. Используйте станок с числовым программным управлением для обработки медной пластины из металлического листа из металлической меди размером 170 мм x 120 мм x 3 мм с чистотой 99,9% (рис. 2A). 2D-чертеж для этого производства приведен в дополнительном файле 1. Используйте мелкозернистую наждачную бумагу, чтобы удалить острые края и грязные остатки. Для изготовления удерживающего кронштейна и изолирующей пластины используйте 3D-принтер и нить из полимолочной кислоты (PLA) диаметром 1,75 мм (рис. 2B, C). Для лучшего качества 3D-принтер должен обеспечивать высоту слоя тоньше 0,2 мм.3D модели представлены в дополнительном файле 2 и дополнительном файле 3. 2. Конструирование узла водяного охлаждения Подготовьте силиконовую трубку, отвержденную платиной, бак насоса, медный блок охлаждения и радиатор (рис. 3A) для сборки узла водяного охлаждения. Подготовьте бритвенное лезвие, ножницы и шестигранный ключ к использованию. Помните об опасности поражения электрическим током из-за использования воды во время сборки. Разрежьте силиконовую трубку на три части рекомендуемой длины 40 см, 50 см и 80 см. При необходимости отрегулируйте длину. Вставьте секции силиконовой трубки из шага 2.2 в отверстия радиатора, бака насоса и медного блока охлаждения, как показано на рисунке 3B. Убедитесь, что все соединения водонепроницаемы. В настоящее время построен узел водяного охлаждения. Подготовьте узел водяного охлаждения, блок питания 12 В, три красных и три черных провода-перемычки, макетную плату и 500 мл очищенной воды. Убедитесь, что на верстаке нет жидкости для электробезопасности. Подсоедините бачки насоса и провода радиатора к источнику питания 12 В через макетную плату (рис. 3C). Макетная плата используется для удобства.ПРИМЕЧАНИЕ: Для более постоянного и безопасного соединения исследователи могут заменить макетную плату паяльными проводами. Откройте крышку бака насоса с помощью плоской отвертки. Используйте воронку для добавления воды до тех пор, пока бак насоса не заполнится примерно на 80% (рис. 3D). Не закрывайте бак насоса после этого наполнения. Включите узел водяного охлаждения, подключив блок питания 12 В или включив его (при наличии выключателя). После включения вода будет течь внутрь узла, и вентиляторы на радиаторе должны перегореть. Из-за потока воды из бака насоса уровень жидкости в баке упадет. Добавьте больше воды в бак насоса, пока он не стабилизируется почти на 2/3 (рис. 3E). Встряхните радиатор, чтобы избавиться от пузырьков воздуха, а затем закройте охлаждающий бак. Прежде чем переходить к следующему шагу, выключите источник питания. 3. Испытание холодных и горячих поверхностей Пельтье ПРИМЕЧАНИЕ: Пельтье, ключевой компонент ступени охлаждения, представляет собой твердотельный активный тепловой насос, который передает тепло с одной стороны на другую21. Одна поверхность Пельтье нагревается, а другая поверхность становится холодной при подаче электроэнергии. По умолчанию производители Пельтье маркируют холодную поверхность перед продажей, но все же полезно вручную проверить ее перед сборкой. Подготовьте настраиваемый блок питания и Пельтье, как показано на рисунке 4A. Убедитесь, что настраиваемый источник питания выключен, чтобы предотвратить возможную опасность поражения электрическим током. Подключите красный провод Пельтье к положительному выходу, а черный провод к отрицательному выходу перестраиваемого блока питания с зажимами типа «крокодил», которые входят в комплект питания (рис. 4B). Включите перестраиваемый блок питания и установите его примерно на 2 В, модулируя ручки напряжения и тока на верхнем ряду блока питания. Сразу же обнаженным пальцем пощупайте две поверхности Пельтье. Одна поверхность становится холодной в течение нескольких секунд. Определив, какая поверхность холодная, немедленно отключите питание и отсоедините Пельтье. Используйте маркер, чтобы обозначить холодную поверхность для будущей сборки. 4. Сборка узла для охлаждения Пельтье с помощью узла водяного охлаждения Как показано на рисунке 4А, подготовьте выключенный узел водяного охлаждения, Пельтье (маркировка холодной поверхности) и термопасту (для улучшения теплопроводности). Очистите все поверхности медного блока охлаждения 70% этанолом (или другим более чистящим раствором) в узле водяного охлаждения. Нанесите около 0,4 г термопасты на одну поверхность медного блока водяного охлаждения и убедитесь, что эта ориентация поверхности предотвратит пересечение или изгиб трубок при обращении вниз. Используйте перчатку для защиты кожи и постарайтесь распределить термопасту тонко и равномерно (рис. 4C). Аналогичным образом очистите горячую поверхность Пельтье, затем нанесите термопасту на поверхность (рис. 4D). Соедините горячую поверхность Пельтье с поверхностью медного охлаждающего блока термопастой. Надавите, чтобы убедиться, что он надежно закреплен. Следуйте ориентации проводов на Пельтье и трубок медного блока охлаждения, как показано на рисунке 4E. Очистите излишки термопасты. Не выключайте блок питания 12 В и настраиваемый блок питания. Подключите Пельтье к перестраиваемому источнику питания, как показано в разделе 3. Повторно проверьте соединения узла электрического и водяного охлаждения, а затем последовательно включите блок питания 12 В и перестраиваемый блок питания. Постепенно включайте перестраиваемый блок питания на 12 В. С предложенным Пельтье ток должен быть около 7,3 А. Подождите 2 мин; температура холодной поверхности Пельтье должна стать холоднее -35 °C. Измерьте эту температуру с помощью инфракрасного термометра (рис. 4F). Не прикасайтесь к холодной поверхности, чтобы не поранить руки. Проверьте все соединения и компоненты, если температура не может быть ниже -30 °C. Пузырьки воздуха внутри узла водяного охлаждения являются возможной причиной неоптимальной эффективности охлаждения. Чтобы обеспечить безопасность на последующих этапах, выключите настраиваемый источник питания, подождите 1 минуту, затем выключите источник питания 12 В. 5. Сборка медной пластины и сапфирового окна в сборе Подготовьте медную пластину, сапфировое окно диаметром 80 мм, термопасту, ленту шириной 4 дюйма и острое лезвие для резки (рис. 5A). Тщательно очистите медную пластину и сапфировое окно 70% этанолом и используйте мелкозернистую наждачную бумагу для сглаживания шероховатых поверхностей. Нанесите термопасту на три внутренние поверхности, как показано на рисунке 5B. Убедитесь, что термопаста покрывает все три поверхности поверхности, но не слишком толстая, около 0.5 мм. Положите медную пластину на столешницу, защищенную бумагой для принтера. Бумага облегчает последующую очистку. Вставьте сапфировое окошко в отверстие для медной пластины (рис. 5C). Убедитесь, что сапфир не вращается во время введения, чтобы термопаста не перемещалась в другие области. Удалите излишки термопасты. Приклейте ленту шириной 4 дюйма к верхней поверхности медной пластины-сапфирового окна в сборе (поверхность с квадратной областью углубления, как показано на рисунке 5D). Избегайте пузырьков воздуха между лентой и медными поверхностями во время склеивания, медленно направляя адгезию с одной стороны на другую. Вырежьте указанные синие пунктирные области ленты с помощью острого лезвия, следуя рисунку 5E. Резка обнажает два отверстия для резьбы, квадратное углубление и площадь сапфирового окна диаметром 70 мм. Заклейте скотчем нижнюю поверхность медной пластины-сапфирового окна в сборе, а затем повторите процедуру резки (только в области сапфира) на этой поверхности, как показано на рисунке 5F.ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь сапфировое окно прикреплено к медной пластине, а медные поверхности защищены от ржавчины. 6. Окончательная сборка этапа охлаждения Убедитесь, что все необходимые узлы и компоненты готовы. Нанесите около 0,4 г термопасты на квадратное углубление медной пластины (рис. 6А). Нанесите около 0,4 г термопасты на холодную поверхность Пельтье. Обратите внимание, что Пельтье уже прикреплен к медному блоку охлаждения (рис. 6B). Соедините холодную поверхность Пельтье с углублением медной пластины с давлением вниз. Очистите всю излишки термопасты (рис. 6C). Установите кронштейн, напечатанный на 3D-принтере, в верхней части медного блока охлаждения, а затем с помощью шестигранного ключа затяните два винта длиной 8-32 дюйма 0.5 дюйма, чтобы прикрепить кронштейн к медной пластине (рис. 6D). Используйте затяжку с низким крутящим моментом, чтобы печатный кронштейн не сломался и не деформировался, чтобы обеспечить надлежащую теплопроводность от Пельтье к меди. Поместите медную пластину в изолирующее основание, напечатанное на 3D-принтере, для тепловой изоляции от настольного стола или основания микроскопа во время работы (рис. 6D). Ступень охлаждения собрана и готова к использованию (рис. 6E). Для микроскопии поместите готовый охлаждающий столик на вертикальную платформу микроскопа (рис. 7A). Сборка ступени охлаждения завершена. Более подробную информацию можно найти в сопутствующей публикации Лаборатории Чунга, которая полностью характеризует подробные стратегии и движение животных20. ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих разделах обсуждаются протоколы медленного, быстрого и резкого охлаждения. Гермафродиты N2 в возрасте L4 или в молодом возрасте были использованы для получения следующих данных. Стратегия медленного охлаждения полезна для иммобилизации культивируемых животных N2 при 20 °C при 6 °C; Животные N2, культивируемые при 15 °C, наиболее сильно иммобилизованы при 1 °C20. Краткое сравнение этих трех протоколов охлаждения приведено в таблице 1. 7. Протокол иммобилизации с медленным охлаждением Переместите тарелку для выращивания с крышкой в холодильник с температурой 4 °C. Переместив пластину для выращивания в холодильник, включите питание 12 В на ступени охлаждения и установите перестраиваемое напряжение питания на 5.5 В. После того, как пластина для выращивания с крышкой пробудет в холодильнике с температурой 4 °C в течение 1 часа, немедленно переведите пластину на стадию охлаждения и снимите крышку (рис. 7A). Такие культивационные пластины обычно имеют температуру около 6 ° C. Предварительно охлажденная ступень стабильна и достаточно холодна, чтобы поддерживать поверхность агара при 6 °C. Если температура поверхности агара изменяется, как измерено или отмечено движение животного, слегка отрегулируйте напряжение, пока оно не стабилизируется на уровне 6 °C. Животные должным образом обездвижены в момент передачи. 8. Протокол иммобилизации с быстрым охлаждением ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия быстрого охлаждения является самым основным методом иммобилизации (см. Фильм 1); однако агаровые пластины праздно занимают сцену в течение длительного времени, достигаянабора T. Кроме того, когда требуется сильная иммобилизация иT-установка составляет 6 °C, время простоя увеличивается примерно до 1 часа20 минут. Включите блок питания 12 В охлаждающей сцены и установите перестраиваемое напряжение питания примерно на 12 В. Подождите 10 минут. Поднесите тарелку для выращивания из инкубатора прямо на стадию охлаждения и снимите крышку. Как только температура поверхности агара снизится до (T set + ΔT) °C, отрегулируйте перестраиваемый источник питания вположение V и подождите, пока агар не достигнетT set. Vset – это подходящее напряжение для стабилизации агара приT-образном наборе. ΔT — это переменная, предотвращающая переохлаждение. В таблице 2 приведена комбинациянаборов T, ΔT и V.ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, представленные в таблице 2 , относятся конкретно к лаборатории Чунг, и поэтому следует отметить, что экспериментальные параметры могут варьироваться в зависимости от уникальных условий окружающей среды и использования каждого отдельного эксперимента. Животные обездвиживаются, когда агар достигаетТ-набора. Иммобилизация улучшается со временем до ~50 мин после начала охлаждения. 9. Протокол иммобилизации с резким охлаждением ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия резкого охлаждения отнимает больше всего времени пользователя, но быстрее всего обездвиживает животных от температуры их выращивания. Включите блок питания 12 В ступени охлаждения и поверните перестраиваемое напряжение питания примерно на 12 В. Держать 10 минут. Доведите незанятую тарелку с агаром до стадии охлаждения. Используйте шаг 8.3 в протоколе иммобилизации с быстрым охлаждением, чтобы стабилизировать температуру поверхности агара призаданном T. Переместите животных из исходной тарелки выращивания в охлаждаемую тарелку, находящуюся на стадии охлаждения. В зависимости от размера небольшого животного ожидается, что животные охладятся доT за считанные секунды и будут обездвижены. Иммобилизация улучшается со временем до ~50 мин после начала охлаждения. 10. Оживление животных после охлаждающей иммобилизации Переместите охлажденную культуральную тарелку обратно в исходный инкубатор или при комнатной температуре. Подождите от 20 минут до 1 ч, пока все черви на тарелке не восстановятся к своему нормальному ползанию и кормлению.