Aufbau und Betrieb einer Kühlstufe zur Immobilisierung von C. elegans auf ihren Kulturplatten

1. Herstellung und Vorbereitung jeder Komponente der Kühlstufe HINWEIS: Die Kühlstufe besteht aus mehreren Komponenten (siehe Materialtabelle). Die meisten Komponenten sind von der Stange. Das Saphirfenster erfordert eine Sonderanfertigung, während die Kupferplatte, die Haltehalterung und die Isolationsplatte vor Ort mit einer computergesteuerten Mühle oder einem 3D-Drucker hergestellt werden können. Nach der ersten Fertigung dauert der spätere Montageprozess ca. 2-3 h. Verwenden Sie eine computergesteuerte Fräsmaschine, um die Kupferplatte aus einem 170 mm x 120 mm x 3 mm großen, zu 99,9 % reinen Kupferblech zu bearbeiten (Abbildung 2A). Die 2D-Zeichnung für diese Fertigung finden Sie in der Ergänzungsdatei 1. Verwenden Sie feinkörniges Schleifpapier, um scharfe Kanten und schmutzige Rückstände zu entfernen. Verwenden Sie zur Herstellung der Haltehalterung und der Isolationsplatte einen 3D-Drucker und Polymilchsäure (PLA)-Filament mit einem Durchmesser von 1,75 mm (Abbildung 2B,C). Für eine bessere Qualität sollte der 3D-Drucker eine Schichthöhe bieten, die feiner als 0,2 mm ist.3D Modelle sind in Supplementary File 2 und Supplementary File 3 enthalten. 2. Aufbau der Wasserkühlung Bereiten Sie den platingehärteten Silikonschlauch, den Pumpentank, den Kupferkühlblock und den Kühler (Abbildung 3A) für den Bau der Wasserkühlungsbaugruppe vor. Bereite eine Rasierklinge, eine Schere und einen Inbusschlüssel vor. Achten Sie auf elektrische Gefahren durch die Verwendung von Wasser während der gesamten Montage. Schneiden Sie den Silikonschlauch in drei Abschnitte mit den empfohlenen Längen von 40 cm, 50 cm und 80 cm. Passen Sie die Länge bei Bedarf an. Stecken Sie die Silikonschlauchabschnitte aus Schritt 2.2 in die Anschlüsse des Kühlers, des Pumpentanks und des Kupferkühlblocks, wie in Abbildung 3B gezeigt. Stellen Sie sicher, dass alle Anschlüsse wasserdicht sind. Die Wasserkühlung ist nun gebaut. Bereiten Sie die Wasserkühlung, ein 12-V-Netzteil, drei rote und drei schwarze Überbrückungsdrähte, ein Steckbrett und 500 ml gereinigtes Wasser vor. Stellen Sie sicher, dass die Werkbank frei von Flüssigkeit ist, um die elektrische Sicherheit zu gewährleisten. Verbinden Sie die Pumpentanks und die Kabel des Kühlers über das Steckbrett mit der 12-V-Stromversorgung (Abbildung 3C). Das Steckbrett wird der Einfachheit halber verwendet.HINWEIS: Für eine dauerhaftere und sicherere Verbindung können Forscher die Steckplatine durch Lötdrähte ersetzen. Öffnen Sie den Tankdeckel der Pumpe mit einem Schlitzschraubendreher. Verwenden Sie einen Trichter, um Wasser hinzuzufügen, bis der Pumpentank zu etwa 80 % gefüllt ist (Abbildung 3D). Verschließen Sie den Pumpentank nach dieser Befüllung nicht. Schalten Sie die Wasserkühlung ein, indem Sie das 12-V-Netzteil einstecken oder einschalten (falls ein Schalter vorhanden ist). Nach dem Einschalten fließt das Wasser in die Baugruppe und die Lüfter am Kühler sollten durchbrennen. Durch den Wasserfluss aus dem Pumpentank sinkt der Flüssigkeitsstand im Tank. Geben Sie mehr Wasser in den Pumpentank, bis er sich bei fast 2/3 voll stabilisiert hat (Abbildung 3E). Schütteln Sie den Kühler, um Luftblasen zu entfernen, und verschließen Sie dann den Kühltank. Schalten Sie die Stromversorgung aus, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. 3. Testen von kalten und heißen Peltier-Oberflächen HINWEIS: Das Peltier, eine Schlüsselkomponente der Kühlstufe, ist eine aktive Festkörperwärmepumpe, die Wärme von einer Seite auf die andere überträgt21. Eine Oberfläche des Peltiers wird heiß und die andere Oberfläche kalt, wenn Strom bereitgestellt wird. Standardmäßig markieren Peltier-Hersteller die kalte Oberfläche vor dem Verkauf, aber es ist dennoch hilfreich, sie vor der Montage manuell zu testen. Bereiten Sie das abstimmbare Netzteil und das Peltier vor, wie in Abbildung 4A gezeigt. Stellen Sie sicher, dass das abstimmbare Netzteil ausgeschaltet ist, um mögliche elektrische Gefahren zu vermeiden. Verbinden Sie das rote Kabel des Peltiers mit dem positiven Ausgang und das schwarze Kabel mit dem negativen Ausgang des abstimmbaren Netzteils mit Krokodilklemmen, die mit dem Netzteil geliefert werden (Abbildung 4B). Schalten Sie das abstimmbare Netzteil ein und stellen Sie es auf etwa 2 V ein, indem Sie sowohl die Spannungs- als auch die Stromregler in der oberen Reihe des Netzteils modulieren. Verwenden Sie sofort einen bloßen Finger, um die beiden Oberflächen des Peltiers zu ertasten. Eine Oberfläche wird innerhalb weniger Sekunden kalt. Nachdem Sie festgestellt haben, welche Oberfläche kalt ist, schalten Sie sofort die Stromversorgung aus und trennen Sie das Peltier. Verwenden Sie einen Marker, um die kalte Oberfläche für die zukünftige Montage anzuzeigen. 4. Konstruktion der Baugruppe zur Kühlung des Peltiers mit Wasserkühlung Wie in Abbildung 4A gezeigt, bereiten Sie die abgeschaltete Wasserkühlung, das Peltier (kalte Oberfläche markiert) und die Wärmeleitpaste (für eine verbesserte Wärmeleitung) vor. Reinigen Sie alle Oberflächen des Kupferkühlblocks mit 70%igem Ethanol (oder einer anderen Reinigungslösung) in der Wasserkühlungsbaugruppe. Tragen Sie ca. 0,4 g Wärmeleitpaste auf eine Oberfläche des Kupfer-Wasserkühlblocks auf und achten Sie darauf, dass diese Oberflächenausrichtung verhindert, dass sich die Rohre kreuzen oder verbiegen, wenn sie nach unten zeigen. Verwenden Sie einen Handschuh, um die Haut zu schützen, und versuchen Sie, die Wärmeleitpaste dünn und gleichmäßig zu verteilen (Abbildung 4C). Reinigen Sie auf ähnliche Weise die heiße Oberfläche des Peltiers und tragen Sie dann die Wärmeleitpaste auf die Oberfläche auf (Abbildung 4D). Verbinden Sie die heiße Peltier-Oberfläche mit der Kupfer-Kühlblockoberfläche mit Wärmeleitpaste. Üben Sie Druck aus, um sicherzustellen, dass es sicher ist. Befolgen Sie die Ausrichtung der Drähte am Peltier und an den Rohren des Kupferkühlblocks, wie in Abbildung 4E gezeigt. Reinigen Sie die überschüssige Wärmeleitpaste. Lassen Sie sowohl das 12-V-Netzteil als auch das abstimmbare Netzteil ausgeschaltet. Schließen Sie das Peltier an die abstimmbare Stromversorgung an, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Überprüfen Sie erneut die Anschlüsse der elektrischen Baugruppe und der Wasserkühlung und schalten Sie dann nacheinander das 12-V-Netzteil und das abstimmbare Netzteil ein. Drehen Sie das abstimmbare Netzteil allmählich auf 12 V. Mit dem vorgeschlagenen Peltier sollte der Strom bei etwa 7,3 A liegen. Warten Sie 2 Minuten; Die Temperatur der kalten Peltier-Oberfläche sollte kälter als -35 °C werden. Messen Sie diese Temperatur mit einem Infrarot-Thermometer (Abbildung 4F). Berühren Sie nicht die kalte Oberfläche, um Verletzungen der Hände zu vermeiden. Überprüfen Sie alle Anschlüsse und Komponenten, wenn die Temperatur nicht unter -30 °C fallen kann. Luftblasen im Inneren der Wasserkühlung sind ein möglicher Grund für eine suboptimale Kühlleistung. Um die Sicherheit in späteren Schritten zu gewährleisten, schalten Sie das abstimmbare Netzteil aus, warten Sie 1 Minute und schalten Sie dann das 12-V-Netzteil aus. 5. Konstruktion der Kupferplatten- und Saphirfensterbaugruppe Bereiten Sie die Kupferplatte, das Saphirfenster mit einem Durchmesser von 80 mm, Wärmeleitpaste, ein 4 Zoll breites Klebeband und eine scharfe Klinge zum Schneiden vor (Abbildung 5A). Reinigen Sie die Kupferplatte und das Saphirfenster vorsichtig mit 70%igem Ethanol und glätten Sie raue Oberflächen mit feinkörnigem Schleifpapier. Tragen Sie die Wärmeleitpaste auf drei Innenflächen auf, wie in Abbildung 5B gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Wärmeleitpaste alle drei Oberflächen bedeckt, aber nicht zu dick ist, etwa 0,5 mm. Legen Sie die Kupferplatte mit Druckerpapier geschützt auf die Tischplatte. Das Papier erleichtert die spätere Reinigung. Setzen Sie das Saphirfenster in das Loch der Kupferplatte ein (Abbildung 5C). Stellen Sie sicher, dass sich der Saphir während des Einsetzens nicht dreht, um zu verhindern, dass sich die Wärmeleitpaste in andere Bereiche bewegt. Überschüssige Wärmeleitpaste entfernen. Kleben Sie das 4 Zoll breite Klebeband auf die Oberseite der Kupferplatte-Saphir-Fensterbaugruppe (die Oberfläche, die den quadratischen Vertiefungsbereich aufweist, wie in Abbildung 5D gezeigt). Vermeiden Sie Luftblasen zwischen dem Klebeband und den Kupferoberflächen während des Einklebens, indem Sie die Haftung langsam von einer Seite zur anderen führen. Schneiden Sie die angegebenen blau gestrichelten Bereiche des Klebebandes mit einer scharfen Klinge aus und folgen Sie Abbildung 5E. Beim Schneiden werden die beiden Gewindelöcher, die quadratische Vertiefung und die Fläche des Saphirfensters mit einem Durchmesser von 70 mm freigelegt. Kleben Sie die Unterseite der Kupferplatte-Saphir-Fensterbaugruppe ab und wiederholen Sie dann den Schneidevorgang (nur Saphirbereich) auf dieser Oberfläche, wie in Abbildung 5F gezeigt.HINWEIS: Jetzt ist das Saphirfenster an der Kupferplatte befestigt und die Kupferoberflächen sind vor Rost geschützt. 6. Endmontage der Kühlstufe Stellen Sie sicher, dass alle wichtigen Unterbaugruppen und Komponenten bereit sind. Tragen Sie etwa 0,4 g Wärmeleitpaste auf die quadratische Vertiefung der Kupferplatte auf (Abbildung 6A). Tragen Sie ca. 0,4 g Wärmeleitpaste auf die kalte Oberfläche des Peltiers auf. Beachten Sie, dass das Peltier bereits am Kupferkühlblock befestigt ist (Abbildung 6B). Verbinden Sie die kalte Peltier-Oberfläche mit der Vertiefung der Kupferplatte mit Abwärtsdruck. Reinigen Sie die überschüssige Wärmeleitpaste (Abbildung 6C). Montieren Sie die 3D-gedruckte Halterung auf der Oberseite des Kupferkühlblocks und ziehen Sie dann mit einem Inbusschlüssel zwei 8-32, 0,5 Zoll lange Schrauben fest, um die Halterung an der Kupferplatte zu befestigen (Abbildung 6D). Verwenden Sie ein Anzugsdrehmoment mit geringem Drehmoment, damit die gedruckte Halterung nicht bricht oder sich verformt, um eine ordnungsgemäße Wärmeleitung vom Peltier zum Kupfer zu gewährleisten. Legen Sie die Kupferplatte in die 3D-gedruckte Isolationsbasis, um sie während des Betriebs von der Tisch- oder Mikroskopbasis zu isolieren (Abbildung 6D). Die Kühlstufe ist montiert und einsatzbereit (Abbildung 6E). Für die Mikroskopie wird die fertige Kühlstufe auf eine aufrechte Mikroskopplattform gelegt (Abbildung 7A). Die Montage der Kühlstufe ist abgeschlossen. Weitere Details sind der begleitenden Publikation des Chung Laboratory zu entnehmen, die die detaillierten Strategien und Tierbewegungen vollständig charakterisiert20. HINWEIS: In den folgenden Abschnitten werden langsame, schnelle und abrupte Kühlprotokolle erläutert. N2-Hermaphroditen im L4- oder jungen Erwachsenenalter wurden verwendet, um die folgenden Daten zu erhalten. Die Strategie der langsamen Abkühlung ist nützlich, um 20 °C kultivierte N2-Tiere bei 6 °C zu immobilisieren; 15 °C kultivierte N2-Tiere sind bei 1 °C am stärksten immobilisiert20. Ein kurzer Vergleich zwischen diesen drei Kühlprotokollen ist in Tabelle 1 dargestellt. 7. Protokoll zur langsamen Kühlung der Immobilisierung Stellen Sie die Anzuchtplatte mit Deckel auf einen 4 °C warmen Kühlschrank. Nachdem Sie die Kultivierungsplatte in den Kühlschrank gebracht haben, schalten Sie die 12-V-Stromversorgung der Kühlstufe ein und stellen Sie die einstellbare Netzspannung auf 5,5 V ein. Nachdem der Kultivierungsteller mit Deckel 1 h im 4 °C-Kühlschrank geblieben ist, überführen Sie den Teller sofort in die Kühlstufe und entfernen Sie den Deckel (Abbildung 7A). Solche Kultivierungsplatten haben in der Regel eine Temperatur von etwa 6 °C. Die vorgekühlte Stufe ist stabil und kalt genug, um die Agaroberfläche bei 6 °C zu halten. Wenn sich die Oberflächentemperatur des Agars ändert, gemessen oder durch Feststellung von Tierbewegungen, die Spannung leicht anpassen, bis sie sich bei 6 °C stabilisiert hat. Die Tiere werden zum Zeitpunkt des Transfers ordnungsgemäß ruhiggestellt. 8. Protokoll zur schnellen Kühlung der Immobilisierung Anmerkungen: Die schnelle Abkühlstrategie ist die grundlegendste Immobilisierungsmethode (siehe Film 1); Agarplatten besetzen jedoch für längere Zeit untätig die Bühne, während sie dasT-Set erreichen. Auch wenn eine starke Immobilisierung erforderlich ist und derT-Wert 6 °C beträgt, verlängert sich die Leerlaufzeit auf etwa 1 h20. Schalten Sie die 12-V-Stromversorgung der Kühlstufe ein und stellen Sie die einstellbare Netzspannung auf etwa 12 V ein. Warten Sie 10 Minuten. Bringen Sie eine Anzuchtplatte aus dem Inkubator direkt in die Kühlphase und entfernen Sie den Deckel. Sobald die Oberflächentemperatur des Agars auf (T-Satz + ΔT) °C sinkt, stellen Sie das einstellbare Netzteil aufV-Einstellung ein und warten Sie, bis der Agar denT-Satz erreicht. Der V-Satz ist die geeignete Spannung, um den Agar beiT-Satz zu stabilisieren. Das ΔT ist eine Variable, die eine Unterkühlung verhindert. Siehe Tabelle 2 für die Kombination ausT-Menge, ΔT undV-Menge.HINWEIS: Die in Tabelle 2 dargestellten Daten beziehen sich speziell auf das Chung-Labor, daher ist zu beachten, dass die experimentellen Parameter je nach den einzigartigen Umgebungs- und Nutzungsbedingungen jedes einzelnen Experiments variieren können. Die Tiere werden bewegungsunfähig gemacht, wenn der Agar denT-Satz erreicht. Die Immobilisierung verbessert sich mit der Zeit bis ~50 min nach Beginn der Abkühlung. 9. Protokoll zur abrupten Kühlung der Immobilisierung Anmerkungen: Die abrupte Kühlstrategie nimmt die meiste Benutzerzeit in Anspruch, immobilisiert die Tiere jedoch am schnellsten von ihrer Kultivierungstemperatur. Schalten Sie die 12-V-Stromversorgung der Kühlstufe ein und drehen Sie die einstellbare Netzspannung auf etwa 12 V. 10 Min. Bringen Sie eine unbesetzte Agarplatte in die Kühlphase. Verwenden Sie Schritt 8.3 im Protokoll zur schnellen Kühlung der Immobilisierung, um die Oberflächentemperatur des Agars beiT-Einstellung zu stabilisieren. Bringen Sie die Tiere von ihrer ursprünglichen Anzuchtplatte auf die gekühlte Platte, die sich auf der Kühlstufe befindet. Aufgrund der Kleintiergröße wird erwartet, dass die Tiere in Sekundenschnelle auf denT-Satz abkühlen und bewegungsunfähig gemacht werden. Die Immobilisierung verbessert sich mit der Zeit bis ~50 min nach Beginn der Abkühlung. 10. Wiederbelebung der Tiere nach der Kühlung der Immobilisierung Bringen Sie die abgekühlte Kulturplatte zurück in den ursprünglichen Inkubator oder auf Raumtemperatur. Warten Sie 20 Minuten bis 1 Stunde, bis alle Würmer auf dem Teller wieder zu ihrem normalen Krabbel- und Fressverhalten zurückgekehrt sind.