تجميع وتشغيل مرحلة التبريد لشل حركة C. elegans على لوحات الاستزراع الخاصة بهم
Summary
تصف هذه الورقة بروتوكولات لبناء وتشغيل مرحلة تبريد لشل حركة C. elegans على ألواح الزراعة الأصلية بشكل جماعي.
Abstract
يمكن أن تكشف طرق الفحص المجهري عالية الدقة في الجسم الحي عن معلومات دقيقة وتفاصيل دقيقة داخل الحيوان النموذجي Caenorhabditis elegans (C. elegans) ، ولكنها تتطلب تجميدا قويا للحيوان لمنع ضبابية الحركة في الصور. لسوء الحظ ، تتطلب معظم تقنيات التثبيت الحالية جهدا يدويا كبيرا ، مما يجعل التصوير عالي الدقة منخفض الإنتاجية. يتم تبسيط تجميد C. elegans إلى حد كبير باستخدام نهج التبريد الذي يمكن بسهولة شل حركة مجموعات بأكملها مباشرة على لوحات الزراعة الخاصة بهم. يمكن لمرحلة التبريد إنشاء والحفاظ على نطاق واسع من درجات الحرارة مع توزيع موحد على لوحة الزراعة. في هذه المقالة ، يتم توثيق العملية الكاملة لبناء مرحلة التبريد. الهدف هو أن الباحث النموذجي يمكنه بناء مرحلة تبريد تشغيلية في مختبره باتباع هذا البروتوكول دون صعوبة. يظهر استخدام مرحلة التبريد باتباع ثلاثة بروتوكولات ، ولكل بروتوكول مزايا لتجارب مختلفة. يظهر أيضا مثال على ملف تعريف التبريد للمرحلة مع اقترابها من درجة حرارتها النهائية وبعض النصائح المفيدة في استخدام تثبيت التبريد.
Introduction
يوفر الفحص المجهري البصري عالي الدقة أداة لا غنى عنها لدراسة الهياكل البيولوجية في الجسم الحي على المستوى دون الخلوي. تتطلب العديد من الدراسات البيولوجية تصويرا بدقة دون الميكرون لحل التفاصيل التشريحية الدقيقة ، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا العصبية1،2 ، وبنية الغشاء3،4 ، وتوطين البروتين5،6. تتطلب الصورة عالية الدقة وقت تعرض من عدة أجزاء من الثانية إلى ثوان ، اعتمادا على طريقة التصوير والمسبار 7,8. لتحقيق أفضل النتائج ، من الضروري تخطيط وإجراء التجارب القائمة على الفحص المجهري بعناية. من الأمور الحاسمة في هذا الجهد طريقة فعالة لإعداد الحيوانات تسهل التصوير عالي الدقة.
الديدان الخيطية C. elegans هي كائن نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة العديد من العمليات البيولوجية9. يزرع هذا الحيوان الصغير عادة على ألواح أجار متوسطة نمو الديدان الخيطية (NGM) ، ويتكاثر بسرعة عن طريق الإخصاب الذاتي ، مما يجعله مناسبا تماما للدراسات واسعة النطاق. تسمح شفافيتها ومجموعة واسعة من تقنيات وضع العلامات بالتصور المباشر لتشريحها الداخلي10,11. تعتبر الهياكل الدقيقة في C. elegans مثالية لدراسة العمليات البيولوجية على المستوى تحت الخلوي ، مثل تجديد الخلايا العصبية12 ، وتنكس الخلاياالعصبية 13 ، وانقسام الخلايا14. تتطلب مثل هذه الدراسات التصوير بدقة دون الميكرون وتثبيت الحيوان بقوة كافية لمنع ضبابية الصورة. يعد التثبيت القوي أمرا بالغ الأهمية بشكل خاص للتقنيات التي تتضمن صورا متعددة في المكان أو الزمان ، مثل مكدسات الصور 3D (أي مكدسات z) والتصوير بفاصل زمني. أي حركة حيوانية بين التعرضات يمكن أن تحجب النتيجة. بالنسبة إلى C. elegans ، يتضمن التثبيت القوي عادة التلاعب اليدوي بالحيوانات الفردية وتركيبها على شرائح باستخدام مخدر15,16. هذه الإجراءات كثيفة الوقت والعمالة تجعل التجارب واسعة النطاق صعبة للغاية. يمكن لاستراتيجية الشلل حيث يتم تجميد الحيوانات بشكل مباشر وعكسي على ألواح الزراعة الأصلية أن تتيح تصويرا عالي الإنتاجية عالي الدقة.
تم عرض تجميد تبريد C. elegans في عدد قليل من الدراسات ولكن لا يتم استخدامه على نطاق واسع. عادة ما يتم دمجه مع جهاز الموائع الدقيقة لزيادة تقييد الحيوانات17،18،19. ومع ذلك ، فإن أجهزة الموائع الدقيقة معقدة ، وتتطلب تدريبا تشغيليا كبيرا ، ولا يمكن دمجها بسهولة مع سير عمل الزراعة الصلبة النموذجية لتجارب C. elegans. وبالتالي ، لا يتم استخدام الموائع الدقيقة على نطاق واسع لتجميد C. elegans. يظهر هنا ، بالتزامن مع المنشور الأخير لمختبرتشونغ 20 ، إدخال نهج جديد لتجميد التبريد باستخدام مرحلة التبريد الكهروحرارية (الشكل 1) لمعالجة أوجه القصور هذه. مع مرحلة التبريد ، يمكن تبريد لوحة زراعة البوليسترين النموذجية 60 مم إلى أي درجة حرارة مستهدفة (مجموعة T) بين -8 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. يمكن لنهج مرحلة التبريد هذا أن يجمد مجموعة كاملة من الحيوانات بسهولة وعكس ذلك بأقل جهد للمستخدم ، مما يلغي 98٪ من وقت معالجة الحيوانات20.
أدناه ، يتم وصف إجراءات بناء مرحلة التبريد من الصفر. باستثناء تصنيع الأجزاء والطباعة ثلاثية الأبعاد ، من المتوقع أن يستغرق الإجراء بأكمله 4 ساعات دون الحاجة إلى أدوات أو خبرات خاصة. بعد ذلك ، يتم وصف ثلاث استراتيجيات تبريد مختلفة بمعدلات تبريد متفاوتة وجهود المستخدم لشل حركة C. elegans على مجهر عمودي نموذجي. قد تعتمد الإستراتيجية المفضلة على تطبيق المستخدم. يتم وصف بروتوكولات استراتيجيات تجميد التبريد الثلاث هذه بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تظهر مرحلة التبريد التصنيع والتجميع والاستخدام في هذه المخطوطة. معظم المكونات هي عناصر جاهزة يمكن شراؤها عبر الإنترنت. بعض المكونات ، مثل الصفيحة النحاسية ونافذة الياقوت ، تحتاج إلى طلب مخصص وقد يستغرق تصنيعها ما يصل إلى 1 شهر. المكونات الأخرى التي يمكن طباعتها 3D يتم تصنيعها بسهولة في معظم المؤسسات البحثية (الجدول التكميلي 1). تحتاج عملية التجميع إلى عدد قليل من الأدوات ويمكن القيام بها بسرعة بواسطة غير خبير في غضون ساعات قليلة. وبالتالي ، يجب أن تكون معظم المختبرات البيولوجية قادرة على تنفيذ هذا الجهاز بسهولة.
تمتلك مرحلة التبريد ونهج تجميد التبريد العديد من التحسينات المهمة على طرق التثبيت الحالية ، مفصلة بعناية في المنشور الأصلي20. باختصار ، تتيح مرحلة التبريد الشلل القوي لمجموعات كبيرة من C. elegans من جميع الأعمار ، بما في ذلك الأجنة والداور ، على لوحات الاستزراع النموذجية الخاصة بهم تحت سير عمل الفحص المجهري القياسي. إنه يلغي الحاجة إلى إعدادات الأجهزة المعقدة ، مثل الموائع الدقيقة ، مع توفير تأثير تثبيت أقوى. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من التعرض الكيميائي السام المحتمل للحيوانات والباحثين حيث لا يتم استخدام أي مواد كيميائية ، مع توفير تأثير تثبيت مماثل. تتيح هذه القدرات التقنية التطبيق الواسع لهذا الجهاز والنهج للعديد من التجارب التي تتطلب فحصا مجهريا عالي الدقة في الجسم الحي على أعداد كبيرة من الحيوانات.
هناك بعض الخطوات الحاسمة أثناء بناء الجهاز ، بما في ذلك جميع تطبيقات المعجون الحراري والشريط العريض لتثبيت نافذة الياقوت على لوحة كوبر. يضمن المعجون الحراري موصلية حرارية قوية عن طريق استبدال الفجوات بمادة مقاومة حرارية منخفضة. لتحقيق أداء التبريد المطلوب ، يجب إدخال العجينة بشكل صحيح بين جميع الأسطح المتاخمة / الملامسة ، بما في ذلك سطح بلتيير البارد إلى الصفيحة النحاسية ، وسطح بلتيير الساخن إلى كتلة التبريد النحاسية ، واللوحة النحاسية إلى نافذة الياقوت. الشريط العريض المطبق على المسرح يعزل الصفيحة النحاسية لمنع التسخين من الهواء والتكثيف ، مما يؤدي إلى الصدأ. كما أنه يقوي الاتصال بين نافذة الياقوت واللوحة النحاسية. وبالتالي ، فإن تطبيق المعجون الحراري والشريط العريض يتطلب عناية إضافية.
في تجربة تجميد التبريد الفعلية ، تعتمد المعلمات الواردة في هذه المخطوطة ، مثل الفولتية والأوقات ، على الخصائص المحددة لألواح الزراعة والمرحلة ، مثل كمية الآجار في الألواح ، وكفاءة المرحلة ، ودرجة الحرارة المحيطة والرطوبة. في التعديلات المستقبلية ، يمكن تثبيت وحدة تحكم التغذية المرتدة ، مثل مشتق التكامل النسبي (PID) ، لضبط إدخال الجهد بنشاط على مرحلة التبريد لتحقيق درجة الحرارة المطلوبة وتثبيتها.
هناك العديد من القيود على تجميد مرحلة التبريد هذه ، مفصلة بعناية في المنشور الأصلي20. باختصار ، يتم تجميد الحيوانات التي يتم تربيتها في درجات حرارة مختلفة بدرجات مختلفة ، والتي قد تحتاج إلى ضبط إضافي. أيضا ، لم يتم تصميم مرحلة التبريد الحالية هذه للمجهر المقلوب. علاوة على ذلك ، قد يؤدي التصوير أو الفحص على صفيحة الزراعة مباشرة إلى تلوث اللوحة.
نحن نصمم إصدارات جديدة من مرحلة التبريد مناسبة لمنصات التصوير المختلفة ، بما في ذلك المجاهر المستقيمة المركبة والمجاهر المقلوبة. ستسمح هذه التصميمات الجديدة بتثبيت تبريد الحيوانات مباشرة على لوحات الاستزراع أثناء التصوير على هذه المنصات. سيستخدم التصوير في مراحل التبريد هذه أهداف غمر الهواء لمسافات طويلة ، على غرار التكوين الرأسي. في الوقت الحاضر ، يمكن أن يكون لأهداف الغمر في الهواء فتحة عددية تصل إلى 0.9 ، والتي توفر دقة حوالي 300 نانومتر لتصوير البروتين الفلوري الأخضر. وبالتالي ، فإن الجمع بين مرحلة التبريد الجديدة والمجهر يمكن أن يسمح بتصوير مضان بدقة دون الميكرون بشكل روتيني.
كما نقدم بعض النصائح المفيدة لاستخدام مرحلة التبريد وفقا لتجربتنا. على سبيل المثال ، يجب على الأفراد التحقق مما إذا كانت هناك أي فقاعات هواء داخل مجموعة تبريد المياه. تعمل فقاعات الهواء على تدهور التبريد إلى سطح بلتيير الساخن وبالتالي تقلل من فعالية التبريد لمرحلة التبريد. في حالة وجود فقاعات هواء ، يجب تشغيل مصدر الطاقة 12 فولت لجعل تدفق المياه واهتزاز جميع مكونات تدفق المياه. يمكن طرد فقاعات الهواء من المناطق المحاصرة وتنفيسها بواسطة خزان المضخة. يجب على الباحثين التأكد من عدم ثني أنابيب تدفق المياه أو تقاطعها عند تجميع مجموعة تبريد المياه. قد يمنع ثني الأنبوب أو عبوره التدفق الكافي للمياه ويقلل من فعالية التبريد. يجب أن تكون وصلات الأنبوب مناسبة وضيقة بشكل صحيح. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام أنبوب ناعم بقطر مختلف بدلا من ذلك لضمان ضيق. لا ينبغي تطبيق اللصق ، حتى لو لم يكن الاتصال ضيقا بدرجة كافية ، حيث قد يؤدي اللصق إلى انسداد أثناء الاستخدام في المستقبل. تؤثر رطوبة الغرفة على أداء التبريد وتدخل التكثيف والجليد في مرحلة التبريد. قبل وضع صفيحة الزراعة على مرحلة التبريد ، يوصى باستخدام منديل ورقي لإزالة التكثيف أو استخدام غرفة التبريد لإزالة الجليد الذي تشكل على نافذة الياقوت بسرعة. يمكن أن يتسبب خزان المضخة ومراوح المبرد في اهتزازات صغيرة في المجهر إذا كانا يعملان على نفس الطاولة. اهتزاز المجهر يطمس الصورة المكتسبة وبالتالي يجب تجنبه. يمكن استخدام وسادة لعزل الخزان والرادياتير ميكانيكيا ، أو يمكن وضعها على طاولة منفصلة قريبة. يمكن أن تصبح مرحلة التبريد مرحلة تسخين عن طريق عكس التوصيل الكهربائي إلى بلتيير.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بنوح جوزيف (قسم الهندسة الحيوية الشمالية الشرقية) لتصنيع الألواح النحاسية.
Materials
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
- Wearne, S. L., et al. New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales. Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).
- Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures. Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Optical techniques for imaging membrane topography. Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).
- Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -. G. Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques. Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).
- Chen, Y., Periasamy, A. Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).
- Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM. Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hobert, O., Loria, P. Uses of GFP in Caenorhabditis elegans. Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols. 47, 203-226 (2005).
- Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 218 (4), (2021).
- Chung, S. H., et al. Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13 (10), (2020).
- Pintard, L., Bowerman, B. Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nature Communications. 2, 271 (2011).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates. iScience. 26 (2), 105999 (2023).
- Zhao, D., Tan, G. A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications. Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).
