C.エレガンスを培養プレートに固定化するための冷却ステージの組み立てと操作

1.冷却ステージの各コンポーネントの製造と準備 注意: 冷却ステージは、いくつかのコンポーネントで構成されています( 材料表を参照)。ほとんどのコンポーネントは既製です。サファイアウィンドウはカスタムオーダーが必要ですが、銅板、保持ブラケット、および絶縁プレートは、コンピューター数値制御ミルまたは3Dプリンターを使用して現場で製造できます。最初の製造後、後の組み立てプロセスには約2〜3時間かかります。 コンピューター数値制御ミルを使用して、170 mm x 120 mm x 3 mm、99.9%純銅金属シートから銅板を加工します(図2A)。この製造の2D図面は、 補足ファイル1に記載されています。細かいサンドペーパーを使用して、鋭いエッジや汚れた残留物を取り除きます。 保持ブラケットとアイソレーションプレートを製造するには、3Dプリンターと直径1.75 mmのポリ乳酸(PLA)フィラメントを使用します(図2B、C)。より良い品質のために、3Dプリンターは0.2 mmより細かい層の高さを提供する必要があります.3Dモデルは 補足ファイル2 と 補足ファイル3で提供されます。 2.水冷アセンブリの構築 水冷アセンブリを構築するために、白金硬化シリコンチューブ、ポンプタンク、銅冷却ブロック、およびラジエーター(図3A)を準備します。かみそりの刃、はさみ、六角レンチを使用できるように準備します。組み立て全体で水を使用することによる電気的危険に注意してください。 シリコンチューブを推奨長さ40 cm、50 cm、および80 cmの3つのセクションにカットします。必要に応じて長さを調整します。 図2.2に示すように、手順3Bに示すように、手順3のシリコンチューブセクションをラジエーター、ポンプタンク、および銅冷却ブロックのポートに差し込みます。すべての接続が防水であることを確認してください。これで水冷アセンブリが構築されました。 水冷アセンブリー、12 V 電源機構、3 本の赤ジャンパー線と 3 本の黒ジャンパー線、ブレッドボード、および 500 mL の精製水を準備します。 電気の安全のために、作業台に液体がないことを確認してください。 ポンプタンクとラジエーターのワイヤーをブレッドボードを介して12V電源に接続します(図3C)。ブレッドボードは便宜上使用されています。注意: より永続的で安全な接続のために、研究者はブレッドボードをはんだ付けワイヤーに置き換えることができます。 マイナスドライバーを使用してポンプタンクキャップを開きます。漏斗を使用して、ポンプタンクが約80%いっぱいになるまで水を追加します(図3D)。この充填後は、ポンプタンクに蓋をしないでください。 12 V電源を差し込むか、スイッチをオンにする(スイッチがある場合)ことにより、水冷アセンブリの電源を入れます。電源を入れると、水がアセンブリ内を流れ、ラジエーターのファンが吹き飛ばされます。 ポンプタンクからの水の流れにより、タンク内の液面が低下します。ポンプタンクがほぼ2/3いっぱいになるまで、ポンプタンクに水を追加します(図3E)。 ラジエーターを振って気泡を取り除き、冷却タンクに蓋をします。 次の手順に進む前に、電源をオフにしてください。 3. ペルチェの低温および高温表面のテスト 注意: 冷却ステージの主要コンポーネントであるペルチェは、一方の側からもう一方の側に熱を伝達するソリッドステートアクティブヒートポンプです21。ペルチェの一方の表面は熱くなり、もう一方の面は電力を供給するときに冷たくなります。デフォルトでは、ペルチェメーカーは販売前に冷たい表面にマークを付けますが、組み立てる前に手動でテストすると便利です。 チューナブル電源機構とペルチェを準備します ( 図 4A を参照)。 電気的危険を防ぐために、チューナブル電源がオフになっていることを確認してください。 ペルチェの赤い線を正の出力に接続し、黒い線を電源に付属のワニ口クリップ付きのチューナブル電源の負の出力に接続します(図4B)。 チューナブル電源をオンにし、電源の一番上の行にある電圧ノブと電流ノブの両方を変調して、約2Vに設定します。すぐに素指でペルチェの2つの表面を感じます。片方の表面は数秒以内に冷たくなります。 どの表面が冷えているかを特定したら、すぐに電源を切り、ペルチェを外します。 マーカーを使用して、将来の組み立てのために冷たい表面を示します。 4. 水冷アセンブリを用いてペルチェを冷却するアセンブリの構築 図4Aに示すように、スイッチオフした水冷アセンブリ、ペルチェ(冷たい表面がマークされています)、およびサーマルペースト(熱伝導を改善するため)を準備します。 水冷アセンブリ内の銅冷却ブロックのすべての表面を70%エタノール(またはその他のクリーナー溶液)で洗浄します。 銅水冷ブロックの一方の表面に約0.4 gのサーマルペーストを塗布し、この面の向きが下を向いたときにチューブが交差したり曲がったりするのを防ぎます。手袋を使用して皮膚を保護し、サーマルペーストを薄く均一に分散させます(図4C)。 同様に、ペルチェの高温の表面をきれいにしてから、サーマルペーストを表面に塗布します(図4D)。 ペルチェ高温面をサーマルペーストで銅冷却ブロック面に接続します。それが安全であることを確認するために圧力をかけます。 図 4E に示すように、ペルチェのワイヤと銅冷却ブロックのチューブの向きに従います。余分なサーマルペーストをきれいにします。 12 V 電源機構とチューナブル電源機構の両方をオフにしてください。セクション3のように、ペルチェをチューナブル電源に接続します。 電気および水冷アセンブリー接続の両方を再確認してから、12 V 電源機構とチューナブル電源機構を順次オンにします。 チューナブル電源を徐々に 12 V に切り替えます。推奨ペルチェを使用すると、電流は約7.3Aになります。 2分間待ちます。ペルチェ低温表面の温度は-35°Cより低くなるはずです。 赤外線温度計でこの温度を測定します(図4F)。手の怪我を防ぐために、冷たい表面に触れないでください。 温度が-30°C未満に到達できない場合は、すべての接続とコンポーネントを確認してください。 水冷アセンブリ内の気泡は、最適ではない冷却性能の考えられる理由です。 後の手順で安全を確保するには、チューナブル電源をオフにし、1 分間待ってから、12 V 電源をオフにします。 5.銅板とサファイアウィンドウアセンブリの構築 銅板、直径80 mmのサファイアウィンドウ、サーマルペースト、幅4インチのテープ、および切断用の鋭利な刃を準備します(図5A)。 銅板とサファイアウィンドウを70%エタノールで慎重に洗浄し、細かいサンドペーパーを使用して粗い表面を滑らかにします。 図5Bに示すように、3つの内面にサーマルペーストを塗布します。サーマルペーストが3つの表面積すべてを覆っているが、厚すぎず、約0.5mmであることを確認してください。 プリンタ用紙で保護されたベンチトップに銅板を置きます。この紙は、後のクリーンアップを容易にします。 サファイアウィンドウを銅板の穴に挿入します(図5C)。サーマルペーストが他の領域に移動するのを防ぐために、挿入中にサファイアが回転しないようにしてください。余分なサーマルペーストを取り除きます。 4インチ幅のテープを銅板サファイアウィンドウアセンブリの上面( 図5Dに示すように、正方形のくぼみ領域がある面)に接着します。貼り付け中は、接着を片側から反対側にゆっくりとガイドすることにより、テープと銅の表面の間に気泡が発生しないようにします。 テープの指定された青い破線の領域を、鋭利な刃物を使用して切り取ります ( 図 5E を参照)。切断により、2つのねじ穴、正方形のくぼみ、およびサファイアウィンドウの直径70mmの領域が露出します。 銅板サファイアウィンドウアセンブリの底面をテープで固定し、 図5Fに示すように、この面で切断手順(サファイア領域のみ)を繰り返します。注意: これで、サファイアウィンドウが銅板に固定され、銅の表面が錆から保護されます。 6.冷却段階の最終組み立て すべての重要なサブアセンブリとコンポーネントの準備ができていることを確認します。 銅板の四角いくぼみに約0.4gのサーマルペーストを塗布します(図6A)。 ペルチェの冷たい表面に約0.4 gのサーマルペーストを塗布します。ペルチェはすでに銅製の冷却ブロックに取り付けられていることに注意してください(図6B)。 ペルチェの冷たい表面を下向きの圧力で銅板のくぼみに接続します。余分なサーマルペーストをすべて取り除きます(図6C)。 3Dプリントされたブラケットを銅製の冷却ブロックの上部に取り付け、六角レンチを使用して2本の8-32、0.5インチの長さのネジを締めてブラケットを銅板に固定します(図6D)。ペルチェから銅への適切な熱伝導を確保するために、印刷されたブラケットが壊れたり変形したりしないように、低トルクの締め付けを使用してください。 銅板を3Dプリントされた絶縁ベースに配置して、操作中にベンチトップまたは顕微鏡ベースから熱絶縁します(図6D)。 冷却ステージが組み立てられ、すぐに使用できます(図6E)。 顕微鏡の場合は、完成した冷却ステージを正立顕微鏡プラットフォームに置きます(図7A)。 冷却ステージの組み立てが完了しました。さらなる詳細は、詳細な戦略と動物の動きを完全に特徴付けるChung Laboratoryのコンパニオン出版物から入手できます20。 メモ: 以下の項では、低速、高速、および急な冷却プロトコルについて説明します。L4または若年成人年齢のN2雌雄同体を使用して、以下のデータを作成しました。徐冷戦略は、20°Cで培養したN2動物を6°Cで固定化するのに役立ちます。15°Cで培養したN2動物は、1°C20で最も強く固定化される。これら3つの冷却プロトコルの簡単な比較を 表1に示します。 7.徐冷固定化プロトコル 蓋をした栽培プレートを4°Cの冷蔵庫に移します。 栽培プレートを冷蔵庫に移動した後、冷却ステージの12 V電源をオンにし、調整可能な電源電圧を5.5 Vに設定します。 蓋付き培養プレートを4°Cの冷蔵庫に1時間置いた後、すぐにプレートを冷却段階に移し、蓋を外します(図7A)。このような栽培プレートは、通常6°C前後である。 予冷されたステージは安定しており、寒天表面を6°Cに維持するのに十分な低温です。 寒天の表面温度が測定または動物の動きに注意して変化した場合は、6°Cで安定するまで電圧をわずかに調整します。 動物は移管時に適切に固定されています。 8.高速冷却固定プロトコル 注意: 急速冷却戦略は、最も基本的な固定方法です(ムービー1を参照)。ただし、寒天プレートは、Tセットに到達している間、長時間ステージをアイドル状態で占有します。また、強力な固定化が必要で、Tセット が6°Cの場合、アイドル時間は約1時間20に延長されます。 冷却ステージの12V電源をオンにし、チューナブル電源電圧を約12Vに設定します。 10分待ちます。 栽培プレートをインキュベーターから直接冷却段階に持ち込み、蓋を外します。 寒天表面温度が(Tセット+ ΔT)°Cに下がったら、チューナブル電源をVセットに調整し、寒天がTセットに達するまで待ちます。Vセットは、Tセットで寒天を安定させるのに適した電圧です。ΔTは過冷却を防ぐ変数です。Tセット、ΔT、およびVセットの組み合わせについては、表2を参照してください。注: 表2 に示されているデータは、特にChung研究所に関するものであるため、実験パラメータは、個々の実験の固有の環境および使用条件に基づいて異なる場合があることに注意してください。 寒天がTセットに達すると動物は固定化されます。固定化は、冷却開始後~50分までの時間とともに改善されます。 9.突然の冷却固定プロトコル 注:突然の冷却戦略は、最も多くのユーザー時間を消費しますが、培養温度から動物を最も急速に固定します。 冷却ステージの12V電源をオンにし、チューナブル電源電圧を約12Vに回します。 10分間保持します。 空いている寒天プレートを冷却ステージに持ち込みます。急速冷却固定化プロトコルのステップ8.3を使用して、Tセットで寒天表面温度を安定させます。 動物を元の栽培プレートから冷却ステージに座っている冷却プレートに移動します。 小動物のサイズに基づいて、動物は数秒で設定された Tまで冷却され、固定されることが期待されます。固定化は、冷却開始後~50分までの時間とともに改善されます。 10.冷却固定化後の動物の復活 冷却した培養プレートを元のインキュベーターまたは室温に戻します。 プレート上のすべてのワームが通常のクロールと摂食動作に復活するまで、20分から1時間待ちます。