הרכבה והפעלה של במת קירור כדי לשתק C. elegans על צלחות התרבות שלהם
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקולים לבנייה והפעלה של שלב קירור כדי לשתק C. elegans על לוחות הגידול המקוריים שלהם בהמוניהם.
Abstract
גישות מיקרוסקופיות in vivo ברזולוציה גבוהה יכולות לחשוף מידע עדין ופרטים קטנים בתוך חיית המודל Caenorhabditis elegans (C. elegans), אך דורשות השתקה חזקה של בעלי חיים כדי למנוע טשטוש תנועה בתמונות. למרבה הצער, רוב טכניקות האימוביליזציה הנוכחיות דורשות מאמץ ידני משמעותי, מה שהופך הדמיה ברזולוציה גבוהה לתפוקה נמוכה. אימוביליזציה של C. elegans מפושטת מאוד על ידי שימוש בגישת קירור שיכולה בקלות לשתק אוכלוסיות שלמות ישירות על לוחות הגידול שלהם. שלב הקירור יכול לבסס ולשמור על טווח רחב של טמפרטורות עם פיזור אחיד על צלחת הגידול. במאמר זה מתועד כל תהליך בניית שלב הקירור. המטרה היא שחוקר טיפוסי יוכל לבנות שלב קירור תפעולי במעבדה שלו בהתאם לפרוטוקול זה ללא קושי. מוצג ניצול שלב הקירור בעקבות שלושה פרוטוקולים, ולכל פרוטוקול יתרונות לניסויים שונים. כמו כן מוצגת דוגמה לפרופיל קירור של השלב כשהוא מתקרב לטמפרטורה הסופית שלו וכמה עצות מועילות בשימוש באימוביליזציה של קירור.
Introduction
מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מספק כלי חיוני לחקר מבנים ביולוגיים in vivo ברמה התת-תאית. מחקרים ביולוגיים רבים דורשים דימות ברזולוציה תת-מיקרונית כדי לפתור פרטים אנטומיים עדינים, כולל מורפולוגיה של נוירונים1,2, מבנה הממברנה3,4 ולוקליזציה של חלבונים 5,6. תמונה ברזולוציה גבוהה דורשת זמן חשיפה של מספר אלפיות שנייה עד שניות, בהתאם לאופן ההדמיה ולבדיקה 7,8. כדי להשיג תוצאות אופטימליות, חיוני לתכנן בזהירות ולבצע ניסויים מבוססי מיקרוסקופיה. חיוני למאמץ זה הוא שיטת הכנה יעילה לבעלי חיים המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה.
הנמטודה C. elegans היא אורגניזם מודל נפוץ לחקר תהליכים ביולוגיים רבים9. בעל חיים קטן זה מעובד בדרך כלל על לוחות אגר בינוניים לגידול נמטודות (NGM), והם מתרבים במהירות על ידי הפריה עצמית, מה שהופך אותם מתאימים היטב למחקרים בקנה מידה גדול. השקיפות שלהם ומגוון רחב של טכניקות תיוג מאפשרים הדמיה פשוטה של האנטומיה הפנימית שלהם10,11. המבנים העדינים ב-C. elegans אידיאליים לחקר תהליכים ביולוגיים ברמה התת-תאית, כגון התחדשות נוירונים 12, ניוון נוירונים13 וחלוקת תאים14. מחקרים כאלה מחייבים הדמיה ברזולוציה תת-מיקרונית והשתקה חזקה מספיק של בעלי חיים כדי למנוע טשטוש תמונה. אימוביליזציה חזקה חיונית במיוחד עבור טכניקות המערבות תמונות מרובות במרחב או בזמן, כגון ערימות תמונות תלת-ממדיות (כלומר, ערימות z) והדמיית קיטועי זמן. כל תזוזה של בעלי חיים בין החשיפות יכולה לטשטש את התוצאה. עבור C. elegans, אימוביליזציה חזקה כוללת בדרך כלל מניפולציה ידנית של בעלי חיים בודדים והרכבתם על שקופיות עם חומר הרדמה15,16. הליכים עתירי זמן ועבודה אלה מקשים מאוד על ניסויים בקנה מידה גדול. אסטרטגיית אימוביליזציה שבה בעלי חיים משותקים באופן ישיר והפיך על לוחות הגידול המקוריים שלהם יכולה לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה בתפוקה גבוהה.
קירור אימוביליזציה של C. elegans הוכח במספר מחקרים, אך אינו בשימוש נרחב. זה בדרך כלל בשילוב עם מכשיר microfluidic כדי לרסן עוד יותר בעלי חיים17,18,19. עם זאת, התקנים מיקרופלואידים הם מורכבים, דורשים הכשרה מבצעית משמעותית, ולא ניתן לשלב אותם בקלות עם זרימות עבודה טיפוסיות של גידול מוצק של ניסויי C. elegans. לפיכך, מיקרופלואידיקה אינה בשימוש נרחב עבור אימוביליזציה של C. elegans. מוצג כאן, יחד עם פרסום20 האחרון של מעבדת צ’ונג, הצגת גישה חדשה של אימוביליזציה של קירור באמצעות שלב קירור תרמואלקטרי (איור 1) כדי לטפל בחסרונות האלה. בשלב הקירור, ניתן לקרר צלחת גידול פוליסטירן טיפוסית בקוטר 60 מ”מ לכל טמפרטורת יעד (T set) בין -8°C לטמפרטורת החדר. גישה זו של שלב הקירור יכולה בקלות ובאופן הפיך לשתק אוכלוסיית בעלי חיים שלמה במאמץ משתמש מינימלי, ולבטל 98% מזמן העיבוד של בעלי החיים20.
להלן מתוארים ההליכים לבניית שלב קירור מאפס. למעט עיבוד שבבי של חלקים והדפסה תלת מימדית, ההליך כולו צפוי להימשך 4 שעות ללא צורך בכלים מיוחדים או מומחיות. לאחר מכן, מתוארות שלוש אסטרטגיות קירור שונות עם קצבי קירור משתנים ומאמצי המשתמש לשתק C. elegans במיקרוסקופ זקוף טיפוסי. האסטרטגיה המועדפת עשויה להיות תלויה ביישום המשתמש. הפרוטוקולים עבור שלוש אסטרטגיות אימוביליזציה אלה מתוארים בפירוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלב הייצור, ההרכבה והשימוש בקירור מוצג בכתב יד זה. רוב הרכיבים הם פריטי מדף שניתן לרכוש באינטרנט. רכיבים מסוימים, כמו לוח הנחושת וחלון הספיר, זקוקים להזמנה מותאמת אישית וייצורם עשוי להימשך עד חודש. רכיבים אחרים הניתנים להדפסה תלת-ממדית מיוצרים בקלות ברוב מוסדות המחקר (טבלה משלימה 1). תהליך ההרכבה דורש כלים ספורים בלבד ויכול להיעשות במהירות על ידי מי שאינו מומחה תוך מספר שעות. לכן, רוב המעבדות הביולוגיות צריכות להיות מסוגלות ליישם בקלות את המכשיר הזה.
לשלב הקירור ולגישת אימוביליזציה של קירור יש מספר שיפורים משמעותיים לעומת שיטות האימוביליזציה הקיימות, שפורטו בקפידה בפרסום המקורי20. בקצרה, שלב הקירור מאפשר אימוביליזציה חזקה של אוכלוסיות גדולות של C. elegans בכל הגילאים, כולל עוברים ודאוורים, על לוחות התרבית הטיפוסיים שלהם תחת תהליכי עבודה סטנדרטיים של מיקרוסקופיה. זה מבטל את הצורך בהגדרות חומרה מורכבות, כמו מיקרופלואידיקה, תוך מתן אפקט אימוביליזציה חזק יותר. בנוסף, הוא ממזער את החשיפה הכימית הרעילה האפשרית לבעלי חיים ולחוקרים מכיוון שלא נעשה שימוש בכימיקלים, תוך מתן אפקט אימוביליזציה דומה. יכולות טכניות אלה מאפשרות יישום רחב של מכשיר זה וגישה לניסויים רבים הדורשים מיקרוסקופ in vivo ברזולוציה גבוהה על מספר רב של בעלי חיים.
ישנם כמה שלבים קריטיים במהלך בניית המכשיר, כולל כל יישום הדבק התרמי והסרט הרחב לקיבוע חלון הספיר לצלחת הקופר. המשחה התרמית מבטיחה מוליכות תרמית חזקה על ידי החלפת רווחים בחומר בעל התנגדות תרמית נמוכה. כדי להשיג את ביצועי הקירור הרצויים, יש להכניס את הדבק כראוי בין כל המשטחים הסמוכים/באים במגע, כולל משטח הקור של פלטייה ללוח הנחושת, המשטח החם של פלטייה לבלוק הקירור מנחושת ולוח הנחושת לחלון הספיר. הסרט הרחב המודבק על הבמה מבודד את לוח הנחושת כדי למנוע חימום מהאוויר ועיבוי, מה שמוביל לחלודה. זה גם מחזק את הקשר בין חלון הספיר ללוח הנחושת. לכן, הן החלת הדבק תרמי ואת סרט רחב דורשים טיפול נוסף.
בניסוי אימוביליזציה של קירור בפועל, הפרמטרים המופיעים בכתב יד זה, כגון מתחים וזמנים, תלויים בתכונות הספציפיות של לוחות הגידול והשלב, כגון כמות האגר בצלחות, יעילות הבמה, טמפרטורת הסביבה והלחות. בשינויים עתידיים, ניתן יהיה להתקין בקר משוב, כמו נגזרת אינטגרלית פרופורציונלית (PID), כדי להתאים באופן פעיל את כניסת המתח לשלב הקירור כדי להשיג את הטמפרטורה הרצויה ולייצב אותה.
ישנן מספר מגבלות של אימוביליזציה זו של שלב הקירור, שפורטו בקפידה בפרסום המקורי20. בקצרה, בעלי חיים שגדלו בטמפרטורות שונות משותקים בדרגות שונות, מה שעשוי להזדקק לכוונון עדין נוסף. כמו כן, שלב קירור נוכחי זה אינו מיועד למיקרוסקופ הפוך. יתר על כן, הדמיה או סינון על צלחת טיפוח ישירות עלול להכניס זיהום לצלחת.
אנו מתכננים גרסאות חדשות של שלב הקירור המתאימות לפלטפורמות הדמיה שונות, כולל מיקרוסקופים זקופים מורכבים ומיקרוסקופים הפוכים. עיצובים חדשים אלה יאפשרו קירור ישיר של בעלי חיים על לוחות תרבית במהלך הדמיה על פלטפורמות אלה. ההדמיה בשלבי קירור אלה תשתמש במטרות טבילה באוויר למרחקי עבודה ארוכים, בדומה לתצורה הזקופה. כיום, מטרות טבילה באוויר יכולות להיות בעלות מפתח צמצם מספרי של עד 0.9, המספק רזולוציה של כ-300 ננומטר להדמיית חלבון פלואורסצנטי ירוק. לפיכך, שילוב של שלב קירור חדש עם מיקרוסקופ יכול לאפשר הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה תת-מיקרונית באופן שגרתי.
אנו מספקים גם כמה טיפים מועילים לשימוש בשלב הקירור בהתאם לניסיון שלנו. לדוגמה, אנשים צריכים לבדוק אם יש בועות אוויר בתוך מכלול קירור המים. בועות אוויר פוגעות בקירור למשטח החם של פלטייה ובכך פוגעות ביעילות הקירור של שלב הקירור. אם קיימות בועות אוויר, יש להפעיל את ספק הכוח 12 V כדי לגרום למים לזרום ויש לנער את כל מרכיבי זרימת המים. ניתן לשטוף בועות אוויר מאזורים לכודים ולאוורר אותן על ידי מיכל המשאבה. על החוקרים לוודא כי צינורות זרימת המים אינם מכופפים או נחצים בעת הרכבת מכלול קירור המים. כיפוף או חציית צינור עלולים למנוע זרימה מספקת של מים ולהפחית את יעילות הקירור. חיבורי הצינור צריכים להיות מתאימים והדוקים. במידת הצורך, ניתן להשתמש במקום צינור רך בקוטר שונה כדי להבטיח אטימות. אין להחיל הדבק, גם אם החיבור אינו הדוק מספיק, שכן הדבק עלול להכניס סתימות במהלך שימוש עתידי. לחות החדר משפיעה על ביצועי הקירור ומציגה עיבוי וקרח בשלב הקירור. לפני הנחת צלחת טיפוח על שלב הקירור, מומלץ להשתמש ברישו נייר כדי להסיר עיבוי או להשתמש בצלעות קירור כדי להסיר במהירות קרח שנוצר על חלון הספיר. מיכל המשאבה ומאווררי הרדיאטור יכולים לגרום לתנודות קטנות במיקרוסקופ אם הם עובדים על אותו שולחן. רטט במיקרוסקופ מטשטש את התמונה הנרכשת ולכן יש להימנע ממנו. כרית יכולה לשמש לבידוד מכני של המיכל והרדיאטור, או שהם יכולים להיות ממוקמים על שולחן סמוך נפרד. שלב הקירור יכול להפוך לשלב חימום על ידי היפוך החיבור החשמלי לפלטייר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לנח יוסף (המחלקה לביו-הנדסה צפון-מזרחית) על עיבוד לוחות נחושת.
Materials
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
- Wearne, S. L., et al. New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales. Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).
- Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures. Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Optical techniques for imaging membrane topography. Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).
- Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -. G. Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques. Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).
- Chen, Y., Periasamy, A. Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).
- Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM. Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hobert, O., Loria, P. Uses of GFP in Caenorhabditis elegans. Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols. 47, 203-226 (2005).
- Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 218 (4), (2021).
- Chung, S. H., et al. Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13 (10), (2020).
- Pintard, L., Bowerman, B. Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nature Communications. 2, 271 (2011).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates. iScience. 26 (2), 105999 (2023).
- Zhao, D., Tan, G. A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications. Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).
