C. elegans'ı kültür plakalarında hareketsiz hale getirmek için bir soğutma aşamasının montajı ve çalıştırılması

1. Soğutma aşamasının her bir bileşeninin imalatı ve hazırlanması NOT: Soğutma aşaması birkaç bileşenden oluşur (bkz. Bileşenlerin çoğu kullanıma hazırdır. Safir pencere özel bir sipariş gerektirirken, bakır plaka, tutma braketi ve izolasyon plakası bir bilgisayar sayısal kontrol değirmeni veya 3D yazıcı ile yerinde üretilebilir. İlk üretimden sonra, daha sonraki montaj işlemi yaklaşık 2-3 saat sürer. Bakır levhayı 170 mm x 120 mm x 3 mm, ,9 saf bakır sacdan işlemek için bir bilgisayarlı sayısal kontrol değirmeni kullanın (Şekil 2A). Bu üretim için 2B çizim Ek Dosya 1’de sağlanmıştır. Keskin kenarları ve kirli kalıntıları gidermek için ince kumlu zımpara kağıdı kullanın. Tutma braketini ve izolasyon plakasını üretmek için, bir 3D yazıcı ve 1,75 mm çapında polilaktik asit (PLA) filamenti kullanın (Şekil 2B, C). Daha iyi kalite için, 3B yazıcı 0,2 mm’den daha ince bir katman yüksekliği sağlamalıdır.3D modeller Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3’te sağlanmıştır. 2. Su soğutma tertibatının inşası Su soğutma tertibatını oluşturmak için platin kürlü silikon tüpü, pompa tankını, bakır soğutma bloğunu ve radyatörü (Şekil 3A) hazırlayın. Kullanıma hazır bir tıraş bıçağı, makas ve altıgen anahtar hazırlayın. Montaj sırasında su kullanımından kaynaklanan elektriksel tehlikelerin farkında olun. Silikon tüpü önerilen uzunlukları 40 cm, 50 cm ve 80 cm olan üç bölüme ayırın. Gerektiğinde uzunluğu ayarlayın. Silikon boru bölümlerini adım 2.2’den itibaren radyatör, pompa tankı ve bakır soğutma bloğunun bağlantı noktalarına Şekil 3B’de gösterildiği gibi takın. Tüm bağlantıların su geçirmez olduğundan emin olun. Su soğutma tertibatı şimdi inşa edildi. Su soğutma tertibatını, 12 V güç kaynağını, üç kırmızı ve üç siyah jumper teli, bir breadboard ve 500 mL arıtılmış suyu hazırlayın. Elektrik güvenliği için tezgahın sıvıdan arındırılmış olduğundan emin olun. Pompa tanklarını ve radyatör kablolarını breadboard üzerinden 12 V güç kaynağına bağlayın (Şekil 3C). Breadboard kolaylık sağlamak için kullanılır.NOT: Daha kalıcı ve güvenli bir bağlantı için, araştırmacılar breadboard’u lehimleme telleriyle değiştirebilirler. Pompa deposu kapağını düz başlı bir tornavida kullanarak açın. Pompa tankı yaklaşık% 80 dolana kadar su eklemek için bir huni kullanın (Şekil 3D). Bu dolumdan sonra pompa deposunu kapatmayın. Su soğutma tertibatını 12 V güç kaynağını takarak veya açarak (bir anahtar varsa) çalıştırın. Açıldıktan sonra, su düzeneğin içine akacak ve radyatör üzerindeki fanlar üflenmelidir. Pompa tankından gelen su akışı nedeniyle, tanktaki sıvı seviyesi düşecektir. Pompa deposuna yaklaşık 2/3 dolulukta stabilize olana kadar daha fazla su ekleyin (Şekil 3E). Hava kabarcıklarından kurtulmak için radyatörü sallayın ve ardından soğutma tankını kapatın. Sonraki adıma geçmeden önce güç kaynağını kapatın. 3. Peltier soğuk ve sıcak yüzeylerin test edilmesi NOT: Soğutma aşamasının önemli bir bileşeni olan Peltier, ısıyı bir taraftan diğer tarafaaktaran katı hal aktif bir ısı pompasıdır 21. Peltier’in bir yüzeyi ısınır, diğer yüzeyi ise elektrik gücü sağlarken soğur. Varsayılan olarak, Peltier üreticileri soğuk yüzeyi satmadan önce işaretler, ancak montajdan önce manuel olarak test etmek yine de yararlıdır. Ayarlanabilir güç kaynağını ve Peltier’i Şekil 4A’da gösterildiği gibi hazırlayın. Olası elektrik tehlikelerini önlemek için ayarlanabilir güç kaynağının kapalı olduğundan emin olun. Peltier’in kırmızı telini pozitif çıkışa ve siyah teli ayarlanabilir güç kaynağının negatif çıkışına, güç kaynağıyla birlikte verilen timsah klipsleriyle bağlayın (Şekil 4B). Ayarlanabilir güç kaynağını açın ve güç kaynağının üst sırasındaki voltaj ve akım düğmelerini modüle ederek yaklaşık 2 V’a ayarlayın. Peltier’in iki yüzeyini hissetmek için hemen çıplak parmağınızı kullanın. Bir yüzey birkaç saniye içinde soğur. Hangi yüzeyin soğuk olduğunu belirledikten sonra, hemen güç kaynağını kapatın ve Peltier’in bağlantısını kesin. Gelecekteki montaj için soğuk yüzeyi belirtmek üzere bir işaretleyici kullanın. 4. Su soğutma tertibatı kullanarak Peltier’i soğutmak için tertibatı inşa etmek Şekil 4A’da gösterildiği gibi, kapatılmış su soğutma tertibatını, Peltier’i (soğuk yüzey işaretli) ve termal macunu (gelişmiş termal iletim için) hazırlayın. Bakır soğutma bloğunun tüm yüzeylerini su soğutma tertibatında% 70 etanol (veya başka bir temiz çözelti) ile temizleyin. Bakır su soğutma bloğunun bir yüzeyine yaklaşık 0,4 g termal macun uygulayın ve bu yüzey oryantasyonunun tüplerin aşağı bakarken geçmesini veya bükülmesini önleyeceğinden emin olun. Cildi korumak için bir eldiven kullanın ve termal macunu ince ve eşit bir şekilde dağıtmaya çalışın (Şekil 4C). Benzer şekilde, Peltier’in sıcak yüzeyini temizleyin, ardından termal macunu yüzeye uygulayın (Şekil 4D). Peltier sıcak yüzeyini bakır soğutma bloğu yüzeyine termal macunla bağlayın. Güvenli olduğundan emin olmak için basınç uygulayın. Peltier üzerindeki tellerin ve bakır soğutma bloğunun borularının yönünü Şekil 4E’de gösterildiği gibi takip edin. Fazla termal macunu temizleyin. Hem 12 V güç kaynağını hem de ayarlanabilir güç kaynağını kapalı tutun. Peltier’i bölüm 3’te olduğu gibi ayarlanabilir güç kaynağına bağlayın. Hem elektrik hem de su soğutmalı montaj bağlantılarını yeniden kontrol edin ve ardından 12 V güç kaynağını ve ayarlanabilir güç kaynağını sırayla açın. Ayarlanabilir güç kaynağını kademeli olarak 12 V’a çevirin. Önerilen Peltier ile, akım 7.3 A civarında olmalıdır. 2 dakika bekleyin; Peltier soğuk yüzeyinin sıcaklığı -35 ° C’den daha soğuk olmalıdır. Bu sıcaklığı kızılötesi termometre ile ölçün (Şekil 4F). Ellerin yaralanmasını önlemek için soğuk yüzeye dokunmayın. Sıcaklık -30 ° C’nin altına ulaşamıyorsa tüm bağlantıları ve bileşenleri kontrol edin. Su soğutma tertibatının içindeki hava kabarcıkları, optimum olmayan soğutma performansının olası bir nedenidir. Sonraki adımlarda güvenliği sağlamak için ayarlanabilir güç kaynağını kapatın, 1 dakika bekleyin ve ardından 12 V güç kaynağını kapatın. 5. Bakır levha ve safir pencere montajı yapımı Bakır plakayı, 80 mm çapında safir pencereyi, termal macunu, 4 inç genişliğinde bir bandı ve kesme için keskin bir bıçağı hazırlayın (Şekil 5A). Bakır plakayı ve safir pencereyi etanol ile dikkatlice temizleyin ve pürüzlü yüzeyleri pürüzsüzleştirmek için ince kumlu zımpara kağıdı kullanın. Termal macunu Şekil 5B’de gösterildiği gibi üç iç yüzeye uygulayın. Termal macunun üç yüzey alanını da kapsadığından ancak çok kalın olmadığından, yaklaşık 0,5 mm olduğundan emin olun. Bakır plakayı yazıcı kağıdı ile korunan tezgahın üzerine yerleştirin. Kağıt, daha sonraki temizliği kolaylaştırır. Safir pencereyi bakır levha deliğine yerleştirin (Şekil 5C). Termal macunun diğer alanlara hareket etmesini önlemek için safirin yerleştirme sırasında dönmediğinden emin olun. Fazla termal macunu çıkarın. 4 inç genişliğindeki bandı bakır levha-safir pencere tertibatının üst yüzeyine yapıştırın ( Şekil 5D’de gösterildiği gibi kare çöküntü alanına sahip yüzey). Yapışmayı yavaşça bir taraftan diğerine yönlendirerek yapıştırma sırasında bant ve bakır yüzeyler arasındaki hava kabarcıklarından kaçının. Şekil 5E’yi izleyerek keskin bir bıçak kullanarak bandın belirtilen mavi kesikli alanlarını kesin. Kesme, safir pencerenin iki diş deliğini, kare çöküntüsünü ve 70 mm çapındaki alanını ortaya çıkarır. Bakır levha-safir pencere tertibatının alt yüzeyini bantlayın ve ardından Şekil 5F’de gösterildiği gibi bu yüzeyde kesme işlemini (yalnızca safir alan) tekrarlayın.NOT: Şimdi, safir pencere bakır levhaya sabitlenir ve bakır yüzeyler paslanmaya karşı korunur. 6. Soğutma aşaması son montajı Tüm gerekli alt montaj ve bileşenlerin hazır olduğundan emin olun. Bakır plakanın kare çöküntüsüne yaklaşık 0.4 g termal macun uygulayın (Şekil 6A). Peltier’in soğuk yüzeyine yaklaşık 0.4 g termal macun uygulayın. Peltier’in bakır soğutma bloğuna zaten bağlı olduğunu unutmayın (Şekil 6B). Peltier soğuk yüzeyini bakır levha çöküntüsüne aşağı doğru basınçla bağlayın. Tüm fazla termal macunları temizleyin (Şekil 6C). 3D baskılı braketi bakır soğutma bloğunun üstüne monte edin ve ardından braketi bakır plakaya sabitlemek için iki adet 8-32, 0,5 inç uzunluğunda vidayı sıkmak için bir altıgen anahtar kullanın (Şekil 6D). Peltier’den bakıra doğru termal iletimi sağlamak için basılı braketin kırılmaması veya deforme olmaması için düşük torklu sıkma kullanın. Çalışma sırasında tezgah üstü veya mikroskop tabanından termal izolasyon için bakır plakayı 3D baskılı izolasyon tabanına yerleştirin (Şekil 6D). Soğutma aşaması monte edilmiş ve kullanıma hazırdır (Şekil 6E). Mikroskopi için, tamamlanmış soğutma aşamasını dik bir mikroskop platformuna yerleştirin (Şekil 7A). Soğutma aşamasının montajı tamamlandı. Daha fazla ayrıntı, Chung Laboratuvarı’nın ayrıntılı stratejileri ve hayvan hareketini tam olarak karakterize eden eşlik eden yayınından edinilebilir20. NOT: Aşağıdaki bölümlerde, yavaş, hızlı ve ani soğutma protokolleri ele alınmıştır. Aşağıdaki verileri üretmek için L4 veya genç erişkin yaştaki N2 hermafroditleri kullanılmıştır. Yavaş soğutma stratejisi, 20 °C ekili N2 hayvanlarını 6 °C’de hareketsiz hale getirmek için kullanışlıdır; 15 °C ekili N2 hayvanları en güçlü şekilde 1 °C20’de hareketsiz hale getirilir. Bu üç soğutma protokolü arasındaki kısa bir karşılaştırma Tablo 1’de gösterilmiştir. 7. Yavaş soğutma immobilizasyon protokolü Yetiştirme plakasını kapağı açık bir şekilde 4 °C’lik bir buzdolabına taşıyın. Yetiştirme plakasını buzdolabına taşıdıktan sonra, soğutma aşamasının 12 V güç kaynağını açın ve ayarlanabilir güç kaynağı voltajını 5,5 V’a ayarlayın. Kapaklı yetiştirme plakası 4 °C buzdolabında 1 saat bekledikten sonra, plakayı hemen soğutma aşamasına geçirin ve kapağı çıkarın (Şekil 7A). Bu tür yetiştirme plakaları genellikle 6 °C civarındadır. Önceden soğutulmuş aşama, agar yüzeyini 6 ° C’de tutacak kadar kararlı ve soğuktur. Agar yüzey sıcaklığı ölçüldüğü gibi veya hayvan hareketine dikkat ederek değişirse, voltajı 6 ° C’de stabilize olana kadar hafifçe ayarlayın. Hayvanlar transfer sırasında uygun şekilde hareketsiz hale getirilir. 8. Hızlı soğutma immobilizasyon protokolü NOT: Hızlı soğutma stratejisi en temel immobilizasyon yöntemidir (bakınız Film 1); Bununla birlikte, agar plakaları Tsetine ulaşırken sahneyi uzun süre boşta tutar. Ayrıca, güçlü bir immobilizasyon gerektiğinde ve Tseti 6 ° C olduğunda, boşta kalma süresi yaklaşık 1 saat20’ye uzatılır. Soğutma aşamasının 12 V güç kaynağını açın ve ayarlanabilir güç kaynağı voltajını yaklaşık 12 V’a ayarlayın. İnkübatöründen doğrudan soğutma aşamasına bir yetiştirme plakası getirin ve kapağı çıkarın. Agar yüzey sıcaklığı (Tseti + ΔT) °C’ye düştüğünde, ayarlanabilir güç kaynağını Vsetine ayarlayın ve agar Tsetine ulaşana kadar bekleyin. Vseti, agar’ı Tsetinde stabilize etmek için uygun voltajdır. ΔT, aşırı soğutmayı önleyen bir değişkendir. Tkümesi, ΔT ve Vkümesinin kombinasyonu için Tablo 2’ye bakın.NOT: Tablo 2’de sunulan veriler özellikle Chung Laboratuvarı ile ilgilidir ve bu nedenle deneysel parametrelerin her bir deneyin kendine özgü çevresel ve kullanım koşullarına bağlı olarak değişebileceği unutulmamalıdır. Agar Tsetine ulaştığında hayvanlar hareketsiz hale getirilir. İmmobilizasyon, soğutmanın başlamasından ~ 50 dakika sonrasına kadar zamanla iyileşir. 9. Ani soğutma immobilizasyon protokolü NOT: Ani soğutma stratejisi en fazla kullanıcı zamanını tüketir, ancak hayvanları yetiştirme sıcaklıklarından en hızlı şekilde hareketsiz hale getirir. Soğutma aşamasının 12 V güç kaynağını açın ve ayarlanabilir güç kaynağı voltajını yaklaşık 12 V’a çevirin. Boş bir agar plakasını soğutma aşamasına getirin. Agar yüzey sıcaklığını Tsetinde stabilize etmek için hızlı soğutma immobilizasyon protokolündeki adım 8.3’ü kullanın. Hayvanları orijinal yetiştirme plakalarından soğutma aşamasında oturan soğutulmuş plakaya taşıyın. Küçük hayvan büyüklüğüne bağlı olarak, hayvanların saniyeler içinde Tsetine soğuması ve hareketsiz hale getirilmesi beklenir. İmmobilizasyon, soğutmanın başlamasından ~ 50 dakika sonrasına kadar zamanla iyileşir. 10. Soğutma immobilizasyonundan sonra hayvanların canlanması Soğutulmuş kültür plakasını orijinal inkübatöre veya oda sıcaklığına geri taşıyın. Plakadaki tüm solucanlar normal tarama ve beslenme davranışlarına dönene kadar 20 dakika ila 1 saat bekleyin.