طريقة جديدة لحقن الخلايا مع الحد الأدنى من الغزو
Summary
تقضي هذه الطريقة على أي غزو كبير أثناء حقن الخلايا الناجم عن محلول تعليق الخلية.
Abstract
حقن الخلايا مباشرة في الأنسجة هو عملية ضرورية في إدارة الخلايا و / أو العلاج البديل. يتطلب حقن الخلية كمية كافية من محلول التعليق للسماح للخلايا بدخول الأنسجة. يؤثر حجم محلول التعليق على الأنسجة ، وهذا يمكن أن يسبب إصابة غازية كبيرة نتيجة لحقن الخلية. تقدم هذه الورقة تقريرا عن طريقة جديدة لحقن الخلايا ، تسمى الحقن البطيء ، والتي تهدف إلى تجنب هذه الإصابة. ومع ذلك ، فإن دفع الخلايا من طرف الإبرة يتطلب سرعة حقن عالية بما فيه الكفاية وفقا لقانون نيوتن لقوة القص. لحل التناقض أعلاه ، تم استخدام سائل غير نيوتوني ، مثل محلول الجيلاتين ، كمحلول تعليق الخلية في هذا العمل. محلول الجيلاتين له حساسية لدرجة الحرارة ، حيث يتغير شكله من هلام إلى سول عند حوالي 20 درجة مئوية. لذلك ، للحفاظ على محلول تعليق الخلية في شكل هلام ، تم تبريد المحقنة في هذا البروتوكول ؛ ومع ذلك ، بمجرد حقن المحلول في الجسم ، حولته درجة حرارة الجسم إلى سول. يمكن أن يمتص تدفق سائل الأنسجة الخلالي المحلول الزائد. في هذا العمل ، سمحت تقنية الحقن البطيء لكرات عضلة القلب بدخول عضلة القلب المضيفة والنقش دون التليف المحيط. استخدمت هذه الدراسة طريقة حقن بطيئة لحقن خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة المنقاة والمشكلة على شكل كرة في منطقة نائية من احتشاء عضلة القلب في قلب الفئران البالغة. في 2 أشهر بعد الحقن ، أظهرت قلوب المجموعات المزروعة وظيفة انقباض محسنة بشكل ملحوظ. علاوة على ذلك ، كشفت التحليلات النسيجية للقلوب البطيئة الحقن عن روابط سلسة بين المضيف وخلايا عضلة القلب الطعم عبر أقراص مقحمة تحتوي على وصلات تقاطع الفجوة. يمكن أن تساهم هذه الطريقة في علاجات الخلايا من الجيل التالي ، لا سيما في الطب التجديدي للقلب.
Introduction
تعد إدارة الخلايا واستبدالها استراتيجيات علاجية جديدة واعدة للأعضاء التالفة بشدة. من بين هذه الاستراتيجيات العلاجية الجديدة ، اجتذب الطب التجديدي للقلب اهتماما كبيرا. ومع ذلك ، فإن الالتهاب الناجم عن الإصابات يتوسط في تكوين ندبة في العديد من الأعضاء1،2،3،4. يتكون قلب الإنسان من حوالي 1010 خلايا عضلية قلبية. لذلك ، من الناحية النظرية 5,6 ، يجب أن تعامل مع أكثر من 109 خلايا عضلية القلب. قد يؤدي إعطاء عدد كبير من خلايا عضلة القلب عن طريق طرق الحقن التقليدية إلى إصابات كبيرة في الأنسجة7. توفر هذه الطريقة طريقة جديدة لحقن الخلايا مع الحد الأدنى من غزو الأنسجة.
يتطلب إعطاء الخلايا في حمة العضو حقنة (حقن). ومع ذلك ، يوجد تناقض في أن الحقن نفسه قد يؤدي إلى إصابة الأنسجة. تسبب إصابة الأنسجة التهابا موضعيا وتندبا غير قابل للشفاء في الأعضاء والأنسجة ، فضلا عن ضعف القدرة على التجدد8،9،10. قلب الثدييات لديه ميل كبير للغاية لتطوير الندوب بدلا من التجدد لأنه يتطلب إصلاحا فوريا للإصابة من أجل تحمل ارتفاع ضغط الدم الناجم عن وظيفة الضخ المستمرة11. يستخدم العلاج بالاستئصال هذا الميل العالي نحو تكوين الندبة ويمنع الدائرة التي من المحتمل أن تخضع لتشكيل ندبة باستخدام عدم انتظام ضربات القلب12. في دراسة سابقة ، لوحظ أن النسيج الندبي عزل خلايا عضلة القلب المحقونة في عضلة القلب المضيفة. وبالتالي ، فإن هذا يمثل القضية المستهدفة التالية التي يجب التغلب عليها للحصول على فعالية علاجية محسنة في الطب التجديدي للقلب.
يلعب تدفق السائل الخلالي النسيجي دورا حيويا في نقل الأكسجين والمواد المغذية إلى الخلايا وإزالة الفضلات المفرزة من الخلايا. تختلف السرعة الفسيولوجية لتدفق السائل الخلالي في كل نسيج / عضو (النطاق هو 0.01-10 ميكرومتر / ثانية)13. على حد علم المؤلف ، لا توجد بيانات تتعلق بقدرة الأنسجة / الأعضاء الفردية على دعم كميات إضافية من السوائل دون وذمة مرضية. ومع ذلك ، تحاول هذه التجربة استخدام سرعة حقن بطيئة لتقليل إصابة الأنسجة ، ويمكن استخدام النتائج لتحديد التطبيق العملي لهذا المفهوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتمثل إحدى النقاط الحرجة في الأداء الناجح لطريقة الحقن البطيء في إعداد نظام حقن فعال باستخدام مضخة حقنة قوية وأنبوب نقل ضغط قوي. مطلوب نظام ضغط عالي لدفع الجل من طرف إبرة دقيقة. النقطة الحرجة الثانية هي استقرار القلب. يمكن أن يؤدي نبض القلب ضد إبرة الحقن المتقدمة في عضلة القلب إلى إصابة الأنسجة. في هذه الدراسة ، تم إجراء حقن موجه بالصدى لتجنب تعرض الحيوانات لإصابة ثانية في الصدر المفتوح ولإدارة حقن الخلايا في قلب مستقر مع تضخم الرئتين. علاوة على ذلك ، في بعض التطبيقات للحيوانات الكبيرة أو البشر ، يجب اعتبار بعض أجهزة الحقن المتصلة بالقلب جزءا من التصميم الاستراتيجي للتطبيق. لحقن الصدر المفتوح في قلوب الحيوانات الصغيرة ، يوصى باستخدام إبرة طويلة ومرنة نظرا لارتفاع معدل ضربات القلب.
في هذا العمل ، زادت طريقة الحقن البطيئة بشكل كبير من حجم خلايا عضلة القلب الباقية مقارنة بطريقة الحقن العادية. الحقن الطبيعي يسبب تلف الخلايا عن طريق إجهاد القص15. في المقابل ، لا تسبب طريقة الحقن البطيء مثل هذا الإجهاد نظريا لأنها تستخدم محلولا غير نيوتوني بالإضافة إلى الحقن البطيء.
من حيث التليف الموضعي ، أظهر الفضاء الخلالي حول خلايا عضلة القلب الباقية على قيد الحياة التي يتم حقنها بشكل طبيعي ترسبا قويا وواسع النطاق للكولاجين من النوع الأول. في المقابل ، كانت إشارات الكولاجين من النوع الأول حول خلايا عضلة القلب المطعمة باستخدام طريقة الحقن البطيء أضعف بكثير وأكثر محدودية. هذا يشير إلى أن طريقة الحقن البطيئة تسببت في ضرر أقل بكثير. أدى الحقن البطيء لخلايا عضلة القلب الوليدية في عضلة القلب البالغة إلى تحسن كبير في وظيفة انقباض القلب المحتشى. أشارت التحليلات النسيجية إلى أن تطعيم الخلايا العضلية القلبية باستخدام طريقة الحقن البطيء أدى إلى اتصالات مباشرة واقتران وظيفي مع خلايا عضلة القلب المضيفة. تشرح هذه الظاهرة آلية الانتعاش الوظيفي لعضلة القلب المضيفة. على حد علمنا ، هذا هو التقرير الأول لخلايا عضلة القلب لحديثي الولادة المطعمة مع اتصالات سلسة واسعة النطاق بخلايا عضلة القلب البالغة المضيفة. قد تؤدي الوصلات الوظيفية مع عضلة القلب المضيفة عبر الاقتران الكهربائي والميكانيكي إلى نضج خلايا عضلة القلب المطعمة والسماح لها بالعمل كخلايا عضلية وظيفية تساهم في وظيفة القلب المضيف. تعد تفاعلات القوة البدنية طويلة المدى بين المضيف وخلايا عضلة القلب الكسب غير المشروع ضرورية للنضج الكامل. لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى 2 أشهر بعد الحقن لاستعادة وظيفية للقلب احتشاء. قد يكون التعافي المعتمد على الوقت لوظيفة قلب المريض ظاهرة متوقعة في التطبيقات العلاجية ، ويمكن أن يكون هذا سمة مميزة للنجاح في إنشاء اقتران وظيفي جديد والتكامل بين المضيف وخلايا عضلة القلب المطعمة.
يمكن إجراء طريقة الحقن البطيء أثناء جراحة الصدر المفتوح. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الفئران. بالنسبة للتطبيقات المستقبلية في العلاج البشري ، ما زلنا بحاجة إلى حل العديد من المشكلات. يجب تحسين سرعة الحقن من خلال النظر في سعة المخزن المؤقت لتدفق السائل الخلالي في كل عضو مستهدف بشري. يجب استخدام مواد خالية من Xeno ، مثل الجيلاتين البشري أو المواد الاصطناعية القابلة للتحلل. يجب تطوير جهاز الحقن البطيء من الدرجة السريرية GMP ، مثل الأدوات المدمجة التي يمكن التخلص منها الخاصة بالأعضاء أو جهاز قابل لإعادة الاستخدام قابل لإعادة الاستخدام.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنحة من JSPS KAKENHI (المنحة رقم 23390072 و 19K07335) و AMED (المنحة رقم A-149).
Materials
| 18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
| 29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
| A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
| Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
| alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
| Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
| Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
| blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
| collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
| confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
| fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
| fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
| fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
| gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
| Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
| non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
| peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
| syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
| syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
| tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
| trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
| Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
| veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
| Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |
References
- Chavkin, N. W., et al. The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation. Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904 (2021).
- Li, H., et al. The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-κB signaling to control kidney fibrosis. Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).
- Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. K. The role of monocytes in optic nerve injury. Neural Regeneration Research. 18 (8), 1666-1671 (2023).
- Weber, F., Treeck, O., Mester, P., Buechler, C. Expression and function of BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 3473 (2023).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Hattori, F., Fukuda, K. Strategies for replacing myocytes with induced pluripotent stem in clinical protocols. Transplantation Reviews. 26 (3), 223-232 (2012).
- Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7 (1), 61-66 (2010).
- Fernandes, S., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (6), 941-949 (2010).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Wendel, J. S., et al. Functional effects of a tissue-engineered cardiac patch from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a rat infarct model. Stem Cells Translational Medicine. 4 (11), 1324-1332 (2015).
- Hattori, F. Technology Platforms for Heart Regenerative Therapy Using Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Cancer Stem Cells, Volume 7: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 33-45 (2012).
- Tao, S., et al. Ablation lesion characterization in scarred substrate assessed using cardiac magnetic resonance. JACC: Clinical Electrophysiology. 5 (1), 91-100 (2019).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends in Cell Biology. 17 (1), 44-50 (2007).
- Hattori, F., Fukuda, K., Yuasa, S. How to purify cardiomyocytes for research and therapeutic purposes. Cardiac Regeneration using Stem Cells. , (2013).
- Li, M., Tian, X., Zhu, N., Schreyer, D. J., Chen, X. Modeling process-induced cell damage in the biodispensing process. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (3), 533-542 (2010).
